肥胖會導致血液中的膽固醇和甘油三酯水平升高，促使脂質(zhì)在動脈壁沉積，形成斑塊，加速動脈粥樣硬化的進展。同時，肥胖還會導致慢性炎癥反應，進一步損傷血管內(nèi)皮，增加心腦血管疾病的風險。脂肪組織在機體代謝和能量平衡中起著至關重要的作用。棕色脂肪組織（Brown adipose tissue, BAT）富含線粒體，能夠利用葡萄糖和脂質(zhì)來產(chǎn)生熱量，在維持哺乳動物體溫和促進能量消耗方面具有關鍵意義。因此，通過增加棕色脂肪的活性以促進能量消耗，為肥胖及動脈粥樣硬化等相關代謝疾病的治療提供新思路。
近日，廈門大學生命科學學院李博安教授、郭慧玲副教授，廈門大學附屬第一醫(yī)院李衛(wèi)華教授，在《Cell Death & Differentiation》期刊上發(fā)表了一篇題為“SOX4 facilitates brown fat development and maintenance through EBF2-mediated thermogenic gene program in mice”的研究論文。該研究闡明了SOX4缺失會破壞棕色脂肪的正常發(fā)育和產(chǎn)熱功能，揭示了SOX4通過EBF2調(diào)控棕色脂肪發(fā)育和功能的分子機制，為肥胖及動脈粥樣硬化等相關代謝疾病的干預和治療提供了新的潛在策略。廈門大學博士后王帥為該論文的第一作者。
文章中引用近岸蛋白產(chǎn)品：PmeI(Novoprotein,Cat#RE106-U050)，用于腺病毒的包裝。
包裝的過表達SOX4的腺病毒，能有效回補因SOX4缺失引起的產(chǎn)熱基因的下調(diào)和脂滴的累積（圖1）。在構建腺病毒載體的過程中，Sox4基因的CDS區(qū)域被克隆到穿梭載體pAdTrack-CMV中，形成pAdTrack-CMV-Sox4質(zhì)粒。然后，PmeI（Novoprotein，Cat#RE106）將pAdTrack-CMV-Sox4質(zhì)粒進行切割，并與一個名為pAdEasy-1的腺病毒骨架質(zhì)粒共轉染入大腸桿菌BJ5183菌株中。重組克隆基于卡那霉素的抗性進行篩選，并通過限制性內(nèi)切酶分析進行驗證。
提取重組質(zhì)粒后使用Pac I限制酶進行線性化。線性化的重組質(zhì)粒以包裝成腺病毒顆粒轉染β-5細胞。
對于腺病毒的純化，當大約三分之一到一半的細胞脫落時，收集細胞和上清液。收集的樣本經(jīng)過三次凍融循環(huán)以釋放病毒顆粒。通過PEG8000沉淀來純化沉淀的病毒顆粒。所得沉淀物進一步通過氯化銫（CsCl）密度梯度離心，在22800g、20°C下離心2.5小時進行純化。通過穿刺離心管小心收集腺病毒帶，并進行過夜透析。測定純化腺病毒的滴度，并將純化的腺病毒分裝以備將來使用。
為了在Sox4-MKO小鼠的棕色脂肪組織中實現(xiàn)SOX4的過表達，注射攜帶SOX4的腺病毒被到設計區(qū)域內(nèi)的棕色脂肪組織中，每只小鼠1010pfu。腺病毒每3天注射兩次。在第7天，對小鼠實施anlesi，并收集注射區(qū)域的棕色脂肪組織進行指定的實驗。
圖1 過表達SOX4 的腺病毒有效回補因SOX4缺失引起的產(chǎn)熱基因的下調(diào)
SOX4是轉錄因子SRY-related high mobility group box（Sox）家族的成員，可以與特定DNA序列結合，重塑染色質(zhì)結構以促進基因轉錄，在調(diào)控細胞干性、細胞分化，以及神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌胰島和心臟發(fā)育中發(fā)揮重要作用，同時也與癌癥發(fā)生密切相關。該研究進一步發(fā)現(xiàn)急性冷刺激能夠上調(diào)棕色脂肪組織中的SOX4表達。在SOX4敲除的棕色脂肪細胞小鼠中，棕色脂肪組織呈現(xiàn)較野生型小鼠更明顯的白化現(xiàn)象，小鼠在急性冷刺激條件下體溫下降更為迅速。與正常野生型小鼠相比，遺傳性肥胖小鼠（ob/ob小鼠）、高脂飲食誘導的肥胖小鼠以及老齡小鼠的棕色脂肪同樣表現(xiàn)出白化現(xiàn)象，且伴隨棕色脂肪組織中SOX4表達顯著降低，這表明SOX4對于棕色脂肪的發(fā)育和功能維持至關重要。
該研究通過RNA-Seq和ChIP-Seq實驗揭示，SOX4可以調(diào)控Ebf2的轉錄，進而影響棕色脂肪組織特異性基因和產(chǎn)熱基因的表達。分析小鼠胚胎不同發(fā)育階段棕色脂肪組織的單細胞轉錄組數(shù)據(jù)，結果顯示在小鼠棕色脂肪組織的早期發(fā)育過程中，SOX4和EBF2的表達在空間上高度一致，且SOX4的表達高峰略早于EBF2。這表明SOX4通過調(diào)控EBF2的表達，對棕色脂肪的早期發(fā)育產(chǎn)生影響。
進一步研究發(fā)現(xiàn)，冷刺激可以激活cAMP-PKA信號通路，促使SOX4磷酸化，從而進入細胞核，增強其對Ebf2的轉錄調(diào)控。此外，SOX4還與EBF2協(xié)同作用，共同激活產(chǎn)熱基因表達的轉錄程序（圖2）。
圖2. SOX4與EBF2協(xié)同作用增強Ebf2和產(chǎn)熱基因的表達