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2018 年 10 月，10X Genomics 推出的 Chromium 單細胞 ATAC 解決方案提供了一種全面的、可擴展的方法來研究分析單個樣本中成百上千個細胞中染色質(zhì)的開放情況。通過轉(zhuǎn)座酶對混合的細胞核懸液進行核 DNA 的切割，然后使用微流控芯片將溶液中的細胞核包裹到油滴中，形成納米級的凝膠珠狀乳狀液（GEMs）。采用 10X 條形碼，對每個細胞核切割的 DNA 加上條形碼。通過文庫構(gòu)建，測序，根據(jù) 10X 條形碼將測序得到的序列關(guān)聯(lián)到每個單獨的細胞核上。

伯豪生物提供：單細胞 ATAC 測序、生信分析全程技術(shù)服務(wù)，承接批量科研、臨床樣本，伯豪生物單細胞 ATAC 測序技術(shù)服務(wù)優(yōu)質(zhì)供應(yīng)商。

1、轉(zhuǎn)座酶切割核 DNA

細胞核懸浮液在包括轉(zhuǎn)座酶的混合液中孵育。轉(zhuǎn)座酶進入細胞核，優(yōu)先在染色質(zhì)的開放區(qū)域?qū)?DNA 片段化。同時，將測序接頭序列添加到片段化的 DNA 片段的末端。

圖 轉(zhuǎn)座酶切割 DNA 示意圖

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2、GEM 生成及 Barcode 添加

在 Chromium Next GEM Chip H 芯片上，使包含有 barcode 的凝膠珠，轉(zhuǎn)座酶切割后的細胞核，混合液（包括 ATAC buffer 和 ATAC 酶），以及油滴進行混合，生成 GEMs。為了達到每個油滴中包含有單個細胞核，需要對細胞核進行有限稀釋，保證生成的大多數(shù) GEMs(~90-99%) 不包含細胞核，而其余的為包含單個細胞核 GEMs。

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GEMs 生成后，凝膠珠會溶解釋放出含有（i) Illumina P5 序列、(ii) 16nt 10X 條形碼序列和（iii) Read 1 (Read 1N) 序列的寡核苷酸。這些核苷酸序列會于片段化的 DNA，以及混合液進行混合。后續(xù)經(jīng)過熱循環(huán)后生成含有 10X barcode 的單鏈 DNA。經(jīng)過孵育后，對 GEMs 進行破油處理，所有 GEMs 中的含有 10X barcode 的單鏈 DNA 混合在一起，并進行回收。

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3、破油后的純化

使用硅烷磁珠清除破油反應(yīng)混合物中殘留的生化試劑。固相可逆固定（SPRI) 珠子用于從樣本中消除未使用的 10X 條形碼。

4、測序文庫的構(gòu)建及質(zhì)檢

通過 PCR 將 P7 接頭以及樣本的標簽（Index N）添加到文庫的兩端，形成包含有 P5 和 P7 接頭序列的文庫，用于 Illumina 橋式 PCR 擴增。

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文庫結(jié)構(gòu)

圖  ATAC 文庫組成示意圖

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通過 Agilent TapeStation High Sensitivity D1000 ScreenTape 對文庫進行質(zhì)檢，結(jié)果如下：

圖 Agilent TapeStation High Sensitivity D1000 ScreenTape 文庫質(zhì)檢結(jié)果

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或者用  Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip 來檢測片段大小，結(jié)果如下：

圖 Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip 質(zhì)檢結(jié)果

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備注：

a、橫坐標表示文庫的片段程度，其中 0 代表核小體 free 的峰。1 代表包含有一個核小體的峰；2 代表包含有 2 個核小體的峰；以此類推。

b、核小體是由 DNA 和組蛋白形成的染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)單位。每個核小體由 146bp 的 DNA 纏繞組蛋白八聚體 1.75 圈形成。核小體核心顆粒之間通過 50bp 左右的連接 DNA 相連。加上兩端的 P5,P7 接頭，barcode，sample index，R1N 序列，長度大概如下：核小體 free 的峰長度 200 多 bp；1 個核小體的峰約為 300 多 bp；2 個核小體的峰約為 500bp，以此類推。

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建議測序深度及參數(shù)

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▲流程精簡時效快： 可檢測單細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域中的開放性染色質(zhì)。

▲通量高： 每個通道 500-10000 個細胞核。

▲效率高： 細胞核捕獲率高達 65%。

▲適用范圍廣： 經(jīng)驗證適用于原代細胞，凍存細胞，新鮮組織等。

▲信息分析： 獲取信息量大，可精細化分析。

▲同一份樣本可實現(xiàn)單細胞 ATAC、mRNA、TCR/BCR 同時測序，并整合數(shù)據(jù)。

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▲類型： 新鮮組織，原代細胞，細胞系等。

▲來源： 血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。

▲樣本量及其它質(zhì)控要求：

▲樣本的保存與運輸：

（1）細胞懸液：建議現(xiàn)場制備，如要運輸，建議使用伯豪生物自主研發(fā)的單細胞保護液，4°C 運輸，48 小時內(nèi)送達伯豪生物實驗室。

（2）血液：EDTA 抗凝的全血，4°C 運輸，2 小時內(nèi)送達伯豪生物實驗室；或提取 PBMC 后凍存，干冰運輸。

（3）組織：建議使用伯豪生物自主研發(fā)的單細胞 ATAC-seq 組織保護液，4°C 運輸，48 小時內(nèi)送達伯豪生物實驗室。

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