?一、 microRNA(small RNA)測(cè)序概述
上海伯豪生物技術(shù)有限公司應(yīng)用Illumina第二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)microRNA及Small RNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，可以一次獲得數(shù)百萬(wàn)條microRNA序列，能夠快速鑒定出不同物種、不同組織、不同發(fā)育階段、不同疾病狀態(tài)下已知和未知的microRNA及其表達(dá)差異。同時(shí)，新一代測(cè)序技術(shù)在microRNA互補(bǔ)鏈、microRNA編輯、microRNA異構(gòu)體檢測(cè)、新microRNA預(yù)測(cè)及microRNA靶基因分析方面也具有重要應(yīng)用意義，為研究microRNA對(duì)細(xì)胞進(jìn)程的作用及其生物學(xué)影響提供了有力工具。上海伯豪生物技術(shù)有限公司應(yīng)用Illumina第二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)microRNA及Small RNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，可以一次獲得數(shù)百萬(wàn)條microRNA序列，能夠快速鑒定出不同物種、不同組織、不同發(fā)育階段、不同疾病狀態(tài)下已知和未知的microRNA及其表達(dá)差異。同時(shí)，新一代測(cè)序技術(shù)在microRNA互補(bǔ)鏈、microRNA編輯、microRNA異構(gòu)體檢測(cè)、新microRNA預(yù)測(cè)及microRNA靶基因分析方面也具有重要應(yīng)用意義，為研究microRNA對(duì)細(xì)胞進(jìn)程的作用及其生物學(xué)影響提供了有力工具。
二、 miRNA測(cè)序技術(shù)特點(diǎn)
1.高靈敏度：理論上可以檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中一個(gè)拷貝的microRNA；
2.高精度：可以檢測(cè)microRNA單個(gè)堿基的差異；
3.不受先驗(yàn)信息的干擾，既能鑒定已知microRNA，又有能力發(fā)現(xiàn)新的microRNA；
4.保留定向信息，用于鏈特異的表達(dá)分析；
5.利用Barcode在單次運(yùn)行中經(jīng)濟(jì)地分析多個(gè)樣品。
三、上海伯豪m(xù)icroRNA（Small RNA)測(cè)序服務(wù)內(nèi)容
????? 對(duì)客戶提供的total RNA或microRNA樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)合格后進(jìn)行microRNA文庫(kù)構(gòu)建、簇生成及上機(jī)測(cè)序。上海伯豪生物microRNA sequencing服務(wù)，為您提供從樣本抽提到數(shù)據(jù)分析的全面綜合服務(wù)，服務(wù)內(nèi)容包括：樣品抽提質(zhì)檢, 文庫(kù)建立，測(cè)序，生物信息學(xué)分析以及數(shù)據(jù)報(bào)告。
數(shù)據(jù)分析流程
1． MicroRNA長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)以驗(yàn)證試驗(yàn)可靠性
應(yīng)用fastx(fastx_toolkit-0.0.13.2)對(duì)測(cè)序原始reads進(jìn)行預(yù)處理，去除接頭序列以及低質(zhì)量序列（包括模糊堿基N，堿基質(zhì)量小于10以及長(zhǎng)度小于18nt的序列），最終給出處理結(jié)果統(tǒng)計(jì)表以及長(zhǎng)度分布圖。
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2． MicroRNA比對(duì)注釋統(tǒng)計(jì)
將測(cè)序得到的序列與Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)，已知rRNA、tRNA、重復(fù)區(qū)、RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù)，以及其它非編碼數(shù)據(jù)庫(kù)如ncRNA，piRNA，Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)已知microRNA進(jìn)行注釋。
下表為經(jīng)過(guò)注釋的結(jié)果，其中分別列出和miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)，pirna數(shù)據(jù)庫(kù)，Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)以及ncRNA數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)情況。
下圖為針對(duì)miRBase種Sus scrofa物種進(jìn)行的比對(duì)注釋統(tǒng)計(jì)：
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由之前所得的注釋結(jié)果，可以作圖來(lái)更進(jìn)一步展示其結(jié)果：
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對(duì)整體的注釋結(jié)果，還可以采取進(jìn)一步的分析，例如：
（1） 統(tǒng)計(jì)堿基偏好性，下圖就是測(cè)序所得序列分別在21,22,23,24長(zhǎng)度上的5’堿基分布情況。
（2）對(duì)于測(cè)序所得序列，可以統(tǒng)計(jì)出其正負(fù)鏈分布情況，以找尋生物學(xué)上的特征。
針對(duì)某單一microRNA，也可以對(duì)其進(jìn)行更深度的分析。
例如，對(duì)其序列的匹配情況進(jìn)行分別統(tǒng)計(jì)：
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還可以對(duì)其對(duì)應(yīng)的microRNA前體二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。
3．? 其它Small RNA的分類(lèi)注釋
將測(cè)序得到的序列與物種所對(duì)應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)有注釋的reads的來(lái)源進(jìn)行分類(lèi)統(tǒng)計(jì)，鑒定并統(tǒng)計(jì)出已知的microRNA及其它各種不同種類(lèi)的small RNA分子。
如下圖，經(jīng)過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分別比對(duì)，可以鑒定并統(tǒng)計(jì)出包括tRNA、rRNA、snoRNA、snRNA的數(shù)量及分布。
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4． 新microRNA預(yù)測(cè)
MicroRNA前體的標(biāo)志性發(fā)卡（hairpin）結(jié)構(gòu)能夠用來(lái)預(yù)測(cè)新的microRNA。對(duì)于測(cè)序結(jié)果中未比對(duì)注釋上的序列，我們將其與該物種的全基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，通過(guò)折疊模型分析，若有序列位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)上，則初步判定該序列為一個(gè)候選的新microRNA。
對(duì)于預(yù)測(cè)出的新microRNA，會(huì)統(tǒng)計(jì)并列出其所位于的染色體，起始位置，終止位置，正負(fù)鏈，以及數(shù)目，長(zhǎng)度，GC含量，最小自由能等數(shù)值。
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對(duì)于新microRNA，我們還會(huì)計(jì)算并繪制出其前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以及其與成熟microRNA之間的位置關(guān)系。
5． 飽和度分析圖表
飽和度分析：隨著測(cè)序量的增加，檢測(cè)到的miRBase上的microRNA是否隨之上升。我們會(huì)將注釋結(jié)果按比例劃分作圖，以觀察樣品測(cè)序結(jié)果注釋的趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)其在生物學(xué)上的合理性。
6． 樣本間microRNA表達(dá)差異的篩選
采用DEGseq R語(yǔ)言包結(jié)合perl腳本將樣品按照客戶的分組情況（如：對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組），進(jìn)行microRNA表達(dá)量的比較分析。在差異分析中，采用TPM（Transcripts per million，公式為：?jiǎn)我籱icroRNA reads數(shù)×106/總reads數(shù)）作為標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。
結(jié)果展示如下：
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差異microRNA表達(dá)模式聚類(lèi)分析
可以對(duì)組間差異表達(dá)的
7． 靶基因預(yù)測(cè)
采用miranda軟件，對(duì)microRNA序列以及對(duì)應(yīng)物種的基因組cDNA序列進(jìn)行可能的靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)。
Miranda軟件比對(duì)結(jié)果示意圖如下：
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或采用TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)關(guān)聯(lián)microRNA的靶基因，結(jié)果形式包含microRNA和靶基因的相關(guān)信息。
8． GO功能顯著性富集分析（靶基因）
9． Pathway顯著性富集分析（靶基因）
伯豪案例
應(yīng)用案例一：雌雄同株異花的毛白楊microRNA的性能分析以及對(duì)靶基因表達(dá)的影響
本研究報(bào)道了與花發(fā)育相關(guān)的miRNAs以及它們的靶基因，根據(jù)基因注釋?zhuān)瑢⑺械陌谢蚍譃樗念?lèi)。第一類(lèi)，花發(fā)育相關(guān)：Pto-F6, Pto-F11, Pto-F14, Pto-F19, Pto-25, Pto-36, Pto-F51, Pto-F54以及Pto-F66。第二類(lèi)，Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)：Pto-F28 和 Pto-F45（雌花特異性miRNA），Pto-F16（雄花特異性miRNA）。第三類(lèi)，激素調(diào)節(jié)相關(guān)：10個(gè)miRNAs（除Pto-F6以外均為雌花特異性）。第四類(lèi)，與DNA甲基化相關(guān)：3個(gè)miRNAs。
原文出處： Sexual dimorphism floral microRNA profiling and target gene expression in andromonoecious poplar (Populus tomentosa). PLoS One. 2013, 8(5):e62681.（IF3.730）?
應(yīng)用案例二：MeCP2調(diào)控DGCR8/Drosha復(fù)合物抑制miRNA加工和樹(shù)突發(fā)育。?
MeCP2是一種甲基化DNA結(jié)合蛋白，負(fù)責(zé)招募轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物并且關(guān)閉基因表達(dá)，重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。?
人類(lèi)MeCP2基因的突變或者拷貝數(shù)增多均會(huì)導(dǎo)致孤獨(dú)癥（Autism）等發(fā)育性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。中科院上海生科院神經(jīng)科學(xué)研究所仇子龍研究組利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)MeCP2基因敲除小鼠海馬區(qū)的成熟小RNA進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn) MeCP2抑制了大量小RNA的產(chǎn)生。該研究揭示了孤獨(dú)癥相關(guān)蛋白MeCP2參與小RNA剪切加工的新功能，并提示此功能很是MeCP2基因突變導(dǎo)致發(fā)育性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)致病機(jī)理。?
原文出處：MeCP2 Suppresses Nuclear MicroRNA Processing and Dendritic Growth by Regulating the DGCR8/Drosha Complex p547. Developmental Cell.2014,28, 547–60.（IF：10.366）
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miRNA測(cè)序服務(wù)應(yīng)用案例