熒光定量PCR詳細(xì)流程和問題解析
一、引物設(shè)計(jì)中的幾個(gè)注意事項(xiàng)
1、 引物設(shè)計(jì)最好用相關(guān)的軟件來進(jìn)行設(shè)計(jì)，考慮引物自身回折、錯(cuò)配、引物二聚體、復(fù)性溫度、產(chǎn)物變性溫度等問題，其中產(chǎn)物的變性溫度是大家不太關(guān)心的問題，但有些產(chǎn)物在一般的95度條件下不能充分解鏈，會嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
2、 引物所設(shè)計(jì)的片斷一定要有足夠的特異性，選擇好片段后，最好到互聯(lián)網(wǎng)中進(jìn)行相關(guān)的搜索，看在樣本的基因組有沒有相擬的基因以及假基因等，如果有，則可選擇特異性更高的區(qū)域。
3、 在進(jìn)行mRNA表達(dá)量的定量，可以在引物設(shè)計(jì)時(shí)考慮基因組的污染問題，即在引物設(shè)計(jì)時(shí)讓兩個(gè)引物跨一個(gè)內(nèi)含子，這樣基因組污染所造成的擴(kuò)增可以區(qū)別出來，或因?yàn)槠芜^大而不能擴(kuò)增
4、 由于mRNA表達(dá)量的定量有一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄的過程，如果逆轉(zhuǎn)錄是用poly（T）作引物，則設(shè)計(jì)的片段盡量靠近poly（A），以免逆轉(zhuǎn)錄的效率影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果用特異性引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，則要考慮引物區(qū)是否存在RNA二級結(jié)構(gòu)的問題
5、 產(chǎn)物片段的大小：定量PCR一般產(chǎn)生片段都不大，不會超過600bp。SybrGreen法一般選擇250-600bp，過大會影響到PCR擴(kuò)增的效率，過小則很難通過融解曲線與引物二聚體分開，但并不是絕對的。Taqman法的擴(kuò)增片段都很小，幾十或是100多，這是其原理造成的。Molecular beacon法對片段大小的要求不高，只要不是太長即可。
二、Sybr Green法的實(shí)驗(yàn)策略：
1、 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化階段，這一階段是最花時(shí)間的，
（1）、 要找到一個(gè)陽性的模板，可以是克隆有基因質(zhì)粒、強(qiáng)陽性樣本或純化的PCR產(chǎn)物等。有了陽性的模板才能進(jìn)行最基本的定量擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，如果有普通PCR的實(shí)驗(yàn)條件，也可以此為基礎(chǔ)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
（2）、 擴(kuò)增出的產(chǎn)物要通過電泳方法確定其大小，以確認(rèn)定量PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物是你的目的基因，有些用戶就發(fā)生過優(yōu)化了幾天的條件才發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段的大小不對，不是自己想要的基因。當(dāng)然，能測個(gè)序什么的最好。并通過融解曲線實(shí)驗(yàn)來確定產(chǎn)生的Tm值以及所用的變性溫度是否已經(jīng)足夠，個(gè)別情況下會出來解鍵不充分的現(xiàn)象。
（3）、 有了基本的PCR條件后，要將陽性模板進(jìn)行倍比稀釋，一般用10倍稀釋。將稀釋的模板帶上陰性對照，分成多份進(jìn)行溫度梯度實(shí)驗(yàn)，對復(fù)性溫度進(jìn)行優(yōu)化，以找出復(fù)性溫度范圍，復(fù)性溫度最好能滿足以下條件：高中低模板濃度下PCR擴(kuò)增效率都很高、陰性模板沒有擴(kuò)增。選擇滿足條件的中間溫度，這樣可以提高實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，不會因?yàn)闃颖竟茉诩訜崮K中的位置不同而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
（4）、 如果找不到合適的條件，如引物二聚體過多，可對引物濃度、Mg2+離子濃度、DMSO含量等進(jìn)行優(yōu)化，然后再進(jìn)行復(fù)性溫度梯度實(shí)驗(yàn)。其中Mg2+離子濃度、DMSO含量都會影響Tm值以及所用的變性溫度。