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土壤DNA提取的解決專家
簡(jiǎn)介
土壤樣品含有大量的微生物，其中絕大部分的微生物都是無(wú)法直接培養(yǎng)進(jìn)行繁殖和研究。從土壤樣品中提取DNA是研究土壤微生物最為有效的方法。目前從土壤樣品中提取微生物DNA的方法主要有直接法和間接法。直接法是指把土壤樣品放在裂解液中，經(jīng)過(guò)有效的破壁方法使微生物的DNA全部釋放到裂解液中，然后再進(jìn)行分離提取，如Zhou的方法。間接法是指將土壤放在一種的緩沖液中，如Buffer PBS等，把微生物從土壤中分離出來(lái)，然后再進(jìn)行DNA的提取。間接法可大大降低土壤中腐殖酸，重金屬鹽對(duì)DNA提取帶來(lái)的影響，但是這種方法會(huì)丟失許多微生物，得到的DNA并非土壤樣品中的全基因組(宏基因組)，目前已經(jīng)很少研究者會(huì)采用這種方法。從土壤樣品中直接提取DNA可最大可能性地獲得全基因組，但是這種方法卻面臨以下幾個(gè)問(wèn)題：
1.???????? 腐殖酸的污染。土壤中，特別是森林，草地土壤含有非常豐富的腐殖酸。腐殖酸是一系列的有機(jī)物分子，部分分腐殖酸同核酸分子非常類似，在純化過(guò)程中非常難于去除。微量的腐殖酸污染都會(huì)導(dǎo)致下游應(yīng)用，如PCR，酶切的失敗。
2.???????? 裂解方法。土壤樣品中含有各種微生物，如細(xì)菌和真菌等。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和真菌都含有非常厚的細(xì)菌壁，讓這些微生物的細(xì)胞壁有效破裂是提取高產(chǎn)量宏基因組DNA的關(guān)鍵。由于土壤樣品的復(fù)雜性，使用酶法(如溶菌酶，破壁酶，蝸牛酶)或液氮研磨都不可行，因?yàn)橥寥乐泻懈鞣N金屬離子或抑制因子導(dǎo)致消化酶的活性失活，或土壤中的沙粒等會(huì)導(dǎo)致液氮研磨很難進(jìn)行。
3.???????? DNA得率難于控制。土壤樣品或因肥沃，或因貧瘠，或因含水量豐富，或因干枯，或因取樣的深淺度，都會(huì)造成微生物數(shù)量和品種發(fā)生劇烈改變。在一個(gè)小范圍的土壤樣品DNA含量往往會(huì)差別成千上百倍。此外，某些土壤中含有的化學(xué)成分，如重金屬鹽，粘土物質(zhì)都會(huì)造成DNA得率降低。
Omega Biotek公司的E.Z.N.A. Soil DNA Kit是目前土壤DNA提取最為優(yōu)化的試劑盒。該試劑盒采用玻璃珠研磨法和熱激化學(xué)破壁法，可不需特殊的珠磨儀，在點(diǎn)動(dòng)渦旋儀就可進(jìn)行，適合于廣大的研究室。試劑盒中HTR Reagent是Omega Biotek公司獨(dú)家開(kāi)發(fā)的腐殖酸吸附劑，能高效去除各種腐殖酸的污染。此外還采用無(wú)醇的硅膠柱純化方式，可高效去除土壤中各種可溶性金屬鹽，以及其它可溶性的抑制因子。該試劑盒已經(jīng)成功地提取如下土壤(部分是客戶反饋)：自然保護(hù)區(qū)森林的土壤(長(zhǎng)達(dá)30-40年森林土壤，表層有30-50cm落葉層)，紅樹(shù)林土壤，草地，耕地，海底泥，污泥，礦石區(qū)泥土，有機(jī)物污染的泥土，池塘泥，垃圾泥，空調(diào)管道堆積物等。
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實(shí)驗(yàn)方法
為表明該試劑盒的優(yōu)勢(shì)性，我們選擇以下不同組織樣品進(jìn)行DNA提取實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。
l????????? 森林類樣品：自然保護(hù)區(qū)森林土壤(廣東黑石頂自然保護(hù)區(qū))和海南島紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)
l????????? 礦石區(qū)樣品：礦石區(qū)水底土壤(濕)和礦石區(qū)地表土壤(干)
l????????? 耕地樣品：稻田土壤，菜地土壤
l????????? 有機(jī)物污染地表樣品：污水溝衍泥和生活垃圾堆放區(qū)
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操作方法（按Soil DNA Kit試劑盒進(jìn)行）簡(jiǎn)單描述以下：
1.???????? 取▲ 0.5g森林土壤/耕地土壤，或 ◆ 4g礦石區(qū)土壤和有機(jī)物污染土壤至15ml離心管中；
2.???????? 加入▲ 0.5g酸洗玻璃珠，或 ◆ 4g酸洗玻璃珠；
3.???????? 加入▲ 1ml Buffer SXL MLus，或 ◆ 8 ml Buffer SXL MLus；
4.???????? 立即在渦旋儀上最高速渦旋3分鐘。
5.???????? 加入▲100ul? ，或◆ 800ul Buffer DS，渦旋15s混勻
6.???????? 轉(zhuǎn)移至預(yù)熱至70oC水浴鍋中，水浴10-15分鐘。
7.???????? 3000 x g離心3分鐘，轉(zhuǎn)移▲800ul，或◆ 7 ml 上清，并加入▲270ul Buffer SP2或◆ 2.3 ml Buffer SP2，渦旋混勻；
8.???????? ▲ 10,000 x g離心5分鐘，或 ◆ 5，000 x g離心10分鐘；
9.???????? 把上清液轉(zhuǎn)稱至新的2ml/15ml離心管中，加入0.7倍的異丙醇。(在處理礦石區(qū)樣品時(shí)和有機(jī)物污染的樣品中，還加入133ul糖原溶液)，渦旋混勻；
10.????? ▲ 10,000 x g離心5分鐘，或 ◆ 5，000 x g離心10分鐘沉淀收集DNA。
11.????? 倒棄上清液，并反扣于吸水紙上5分鐘；
12.????? 加入200 ul Elution Buffer，渦旋5秒。 65℃水浴20-60分鐘，讓DNA充分溶液。
13.????? 加入50ul HTR,反應(yīng)2min后，離心，取上清。
14.????? 上清加入等體積（約200ul） XP2 Buffer，均勻后上柱。
15.????? 加入300ul XP2 Buffer，洗滌一次。
16.????? 加入700ul SPW Wash Buffer，洗滌兩次。
17.????? 空甩后，加入適當(dāng)量的Elution Buffer洗脫即可。
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實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.?????? DNA電泳結(jié)果
取10 ul 純化的基因組DNA上樣于0.8%瓊脂糖凝膠，80V電泳30分鐘，結(jié)果如下。
0.5g森林類土壤樣品
(前兩個(gè)自然保護(hù)區(qū)森林土壤，后兩個(gè)為紅樹(shù)林土壤)
0.5g耕地類土壤樣品
A: 水稻田土壤
B: 玉米土壤
4g 有機(jī)物污染土壤樣品
A: 生活垃圾堆放地
B: 污水溝底泥
4g 礦石泥
1和3是兩個(gè)礦石區(qū)水底土壤(濕)
2和4礦石區(qū)地表土壤(干)
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2.?????? DNA純度和產(chǎn)量分析
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土壤類型 |
A260 |
A280 |
A230 |
A320 |
A260/A280 |
產(chǎn)量ug |
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6 |
0.1792 |
0.1041< | | 