?傷口愈合實(shí)驗(yàn)是體外研究細(xì)胞遷移的的一個(gè)有用的實(shí)驗(yàn)。原理是人為的在鋪板的單層細(xì)胞中制造一個(gè)空白的無細(xì)胞的地帶，然后對(duì)這個(gè)無細(xì)胞地帶的邊緣的細(xì)胞進(jìn)行觀察；這些邊緣的細(xì)胞會(huì)開始進(jìn)行遷移活動(dòng)，并且最終覆蓋整個(gè)無細(xì)胞的區(qū)域，重新互相接觸在一起。法國的科研人員在2015年的?STEM?CELL上發(fā)的文章中提出神經(jīng)生長因子（NGF）和神經(jīng)生長因子前體（proNGF）會(huì)自動(dòng)的激活乳腺癌干細(xì)胞，并且發(fā)生侵襲。文中，使用乳腺癌細(xì)胞系和腫瘤分離的細(xì)胞進(jìn)行傷口愈合實(shí)驗(yàn)，得出，由NGF處理的腫瘤離的乳腺癌細(xì)胞的傷口愈合速率有非常顯著的提高。說明在NGF能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移活動(dòng)。
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Nerve?Growth?Factor?and?proNGF?Simultaneously?Promote?Symmetric?Self-Renewal,?Quiescence,?and?Epithelial?to?Mesenchymal?Transition?to?Enlarge?the?Breast?Cancer?Stem?Cell?Compartment
E.?Tomellini,?Y.?Touil,?C.?Lagadec,?S.?Julien,?P.?Ostyn,?N.?Ziental-Gelus,?S.?Meignan,?J.?Lengrand,?E.?Adriaenssens,?R.?Polakowska?and?X.?Le?Bourhis
STEM?CELLS,?2015,?10.1002/stem.1849
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在文中，使用Ibidi開發(fā)的傷口愈合插件進(jìn)行了傷口愈合實(shí)驗(yàn)。這是一種雙孔的硅膠插件，可以放在培養(yǎng)皿中，插件兩孔間的孔壁寬度為500μm。將細(xì)胞種在插件中，等待細(xì)胞貼壁長滿后，將插件移除，這樣，兩孔間的縫隙就是一個(gè)無細(xì)胞的“劃痕”。
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一.實(shí)驗(yàn)材料
1)?細(xì)胞:?????MCF-7?、腫瘤分離細(xì)胞
2)?實(shí)驗(yàn)耗材:???傷口愈合插件培養(yǎng)皿?(ibidi,?81176)?
3)?細(xì)胞培養(yǎng)基:??MEM?medium
4)?試劑:??EGF??（sigma，?E9644）
???????????bFGF?（R&D，233-FB）
???????????NGF??（Scil?Protein）
???????????proNGF?（Alomone?Labs，N-285）
5)?滅菌鑷子
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一.實(shí)驗(yàn)步驟
1.鋪細(xì)胞（圖三）
●?將ibidi傷口愈合培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶撕除。
●?在ibidi細(xì)胞插件的每孔中加入1?×?104的細(xì)胞懸液。注意不要大力晃動(dòng)培養(yǎng)皿。以防止細(xì)胞不均勻。
●?在37。C培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。
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圖三：A.?去除培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶。B.C.在ibidi傷口愈合插件中加入細(xì)胞。
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1.形成“劃痕”
●?采用無血清MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞4小時(shí)
●?如圖四所示，小心的用鑷子夾住插件的一個(gè)角，將插件移除。?
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●?移除插件后，要用顯微鏡檢查是否形成合格的“劃痕”。
●?小心的清洗細(xì)胞，之后加入2ml培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（圖五）。
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1.采集并分析圖像
●?在顯微鏡下選取能同時(shí)看到“劃痕”和兩邊細(xì)胞的視野進(jìn)行成像，“劃痕”的方向最好是水平或者垂直。
●?采集0h和4h的圖像，并且分析每張圖的細(xì)胞覆蓋劃痕區(qū)的面積。
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（三）實(shí)驗(yàn)結(jié)果
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如圖所示，ML表示MCF-7?細(xì)胞系。腫瘤分離細(xì)胞團(tuán)分別由EGF、bFGF、NGF和proNGF處理，由t-EGF/bFGF、t-NGF、t-proNGF表示。可以看到由NGF處理的細(xì)胞，在4h的時(shí)候覆蓋面積最大，遷移速率最快。