小鼠半乳糖凝集素 3 ELISA 試劑盒
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產(chǎn)品編號：SEKM-0083
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適用于小鼠血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液等樣本
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背景介紹：
? ? ?小鼠半乳糖凝集素 3 是凝集素家族的一員，包括 15 種哺乳動物凝集素。與所有的半乳糖類凝集素一樣， 小鼠半乳糖凝集素 3 含有一個由 130 個氨基酸組成的碳水化合物識別結(jié)合區(qū)，能夠與β-半乳糖類特異結(jié)合， 該蛋白參與細(xì)胞粘附、細(xì)胞活化、趨化、細(xì)胞生長和分化、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。小鼠半乳糖凝集素 3 誘 導(dǎo)促炎細(xì)胞因子，抑制 Th2 型細(xì)胞因子的產(chǎn)生。它能吸引單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，激活和脫顆粒嗜堿性細(xì)胞 和肥大細(xì)胞。據(jù)報道，小鼠半乳糖凝集素 3 敲除小鼠在巨噬細(xì)胞和庫普弗細(xì)胞中的吞噬能力降低，表明該 蛋白參與巨噬細(xì)胞吞噬功能。小鼠半乳糖凝集素 3 被證明與癌癥、炎癥、纖維化、心臟病和中風(fēng)有關(guān)，也 被證明與心力衰竭相關(guān)的多種過程，包括肌成纖維細(xì)胞增殖、組織修復(fù)、炎癥、纖維化、心室重塑等，都 與高血糖素-3 的表達(dá)有關(guān)。此外，小鼠半乳糖凝集素 3 還被發(fā)現(xiàn)有助于免疫系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞逃逸，越來越 多地被用作診斷指標(biāo)。對于不同的腫瘤，可以篩選和作為預(yù)測腫瘤進(jìn)展的預(yù)后因子。小鼠半乳糖凝集素 3 的過表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)化、腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外細(xì)胞的粘附以及隨后的轉(zhuǎn)移性轉(zhuǎn)移有關(guān)。
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檢測原理：
? ? ? Solarbio ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。將抗小鼠 Galectin-3 單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上；分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)稀釋的樣本，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小 鼠 Galectin-3 會與酶標(biāo)板上的包被抗體充分結(jié)合；洗板后加入生物素化抗小鼠 Galectin-3 抗體，該抗體會與 板子上包被抗體捕獲的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠 Galectin-3 發(fā)生特異性結(jié)合；洗板后加入辣根過氧化物酶 （HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發(fā)生高強(qiáng)度的非共價結(jié)合；洗板后加入顯色劑底物 TMB， 若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的小鼠 Galectin-3，則 HRP 會使無色 TMB 變成不同深淺（正相關(guān)）的藍(lán)色物 質(zhì)，加入終止液后反應(yīng)孔會變成黃色；最后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應(yīng)孔樣品吸光度（OD）， 樣本中的小鼠濃度與 OD 成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計算出樣本中小鼠的濃度。
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原理圖：
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注意事項(xiàng)：
1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時應(yīng)保存在 2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請?jiān)谑覝鼗謴?fù) 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測，且加入試劑的順序應(yīng)保持一致。
5. 為避免交叉污染，請?jiān)谠囼?yàn)中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。
6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運(yùn)輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確，每次檢測均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
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安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護(hù)；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。
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試劑盒組成及儲存：
自備實(shí)驗(yàn)器材（不提供，可代購）
1． 酶標(biāo)儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機(jī)或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管
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樣本收集及儲存：
1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：
將細(xì)胞培養(yǎng)基移至無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請?jiān)俅坞x心，避免反復(fù)凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min ，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標(biāo)物檢測濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的最高值，請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實(shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù)。
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試劑準(zhǔn)備：
1. 試劑回溫：首先在實(shí)驗(yàn)前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預(yù)先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3.?標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）1000?8?6L至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其完全溶解后 輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，按照以下濃度進(jìn)行2倍稀釋：1000、500、250、125、62.5、31.25、 15.625、0pg/ml進(jìn)行稀釋。2000pg/ml作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高點(diǎn)濃度，標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）作為標(biāo) 準(zhǔn)曲線的零點(diǎn)（0pg/ml）。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液（2000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量 分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。
4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計算好試驗(yàn)所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請?jiān)?0分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。
5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗(yàn)所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1 倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請?jiān)?0分鐘內(nèi)使用。
6. 洗滌方法：?
自動洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔,注 與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。?
手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止 30 秒后甩 凈酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。
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結(jié)果判斷：
1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長檢測，請 用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。
2.計算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均 OD 值：每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值
3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中含量可通過對應(yīng)OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。
4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù)。
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參數(shù)表征：
1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線
本圖僅供參考，應(yīng)以當(dāng)次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算小鼠 Galectin-3的樣本含量
2. 靈敏度：
最低可檢測小鼠 Galectin-3?濃度達(dá) 8pg/ml，
20 個零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個標(biāo)準(zhǔn)差，計算相應(yīng)的可檢測濃度。
3. 特異性：
不與小鼠 Galectin-1 人的 Galectin-2、Galectin-4 等反應(yīng)。
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4. 重復(fù)性：
板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%。
5. 回收率：
在選取的健康小鼠血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的小鼠 Galectin-3，計算回收率。
6. 線性稀釋：
分別在選取的 4 份健康小鼠血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 Galectin-3，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀 釋，評估線性。
