一、皮膚組織的結(jié)構(gòu)
皮膚指披覆在人體的表層，直接與外界環(huán)境相接觸的組織。皮膚是人體最大的器官之一，約占體重的16%。皮膚可以分為三大層，從內(nèi)到外依次為皮下組織、真皮層和表皮層。表皮層是人體最外面的一層組織，屬于復(fù)層鱗狀上皮。角質(zhì)形成細胞又稱上皮細胞，占表皮細胞的95%以上，代謝活躍，能連續(xù)不斷的進行細胞分化和更新。在其分化和成熟的不同階段，細胞的形態(tài)、大小及排列均有不同。根據(jù)角質(zhì)形成細胞各發(fā)展階段的特點，將表皮分為5層，由內(nèi)向外依次分為基底層、棘層、顆粒層、透明層和角質(zhì)層，反映了表皮細胞在角質(zhì)化過程中的演變，其中基底層、棘層又合稱表皮生發(fā)層。角質(zhì)層由多層角化上皮細胞（核及細胞器消失，細胞膜較厚）構(gòu)成，無生命，不透水，具有防止組織液外流，抗磨擦和防感染等功能。生發(fā)層的細胞不斷增生，逐漸向外移行，以補充不斷脫落的角質(zhì)層。生發(fā)層內(nèi)含有一種黑色素細胞，能產(chǎn)生黑色素。皮膚的顏色與黑色素的多少有關(guān)。真皮層由致密結(jié)締組織構(gòu)成，由淺入深依次為乳頭層和網(wǎng)狀層，兩層之間無明顯界限。乳頭層與表皮的生發(fā)層相連，其中有豐富的毛細血管、淋巴管、神經(jīng)末梢和觸覺小體等感受器。網(wǎng)狀層與皮下組織相連，其內(nèi)有豐富的膠原纖維，彈力纖維和網(wǎng)狀纖維。它們互相交織成網(wǎng)，使皮膚具有較大彈性和韌性。皮下組織分布于真皮和肌膜之間，上方與真皮、下方與肌膜緊密連接，廣泛分布于體表，形成所謂脂肪層。皮下脂肪層是儲藏能量的倉庫，又是熱的良好絕緣體，此外還可緩沖外來的沖擊，保護內(nèi)臟器官。
二、皮膚組織的研究方向及研究方法
皮膚組織功能
保護：這是皮膚最重要的功能。皮膚充當了一道與外界隔絕的屏障。皮膚還攜帶蛋白質(zhì)（角蛋白）和色素（黑色素）。黑色素作為光敏色素能高效抵御紫外線，確保生物不會被太陽光線過度傷害。
感覺：皮膚是人體的主要感覺器官之一。皮膚能感知觸覺、熱量、壓力、寒冷等，被軀體感覺受體所覆蓋，這些受體將這些感覺作為信號傳遞給大腦。因此，生物可以對特定的刺激做出適當?shù)姆磻?yīng)。
溫度調(diào)節(jié)：這是皮膚的另一個主要功能。皮膚內(nèi)的汗腺將汗液釋放到皮膚外層，然后蒸發(fā)排出身體熱量。雞皮疙瘩現(xiàn)象也是一種溫度調(diào)節(jié)反應(yīng)。
儲存：皮膚可以在其組織中儲存脂質(zhì)和水分，從而為身體提供額外的絕緣。
分泌氣味信號：皮膚汗腺分泌的汗液也可以作為其他生物體的信號。
內(nèi)分泌：皮膚有助于維生素D的合成。當皮膚暴露在大量的紫外線下，比如太陽光（人造光也起作用），皮膚的基底層和棘層會產(chǎn)生維生素D3。這是因為在皮膚中發(fā)現(xiàn)的一種化學(xué)物質(zhì)，即7-脫氫膽固醇，會與紫外線發(fā)生反應(yīng)。但過度暴露于紫外線會引發(fā)多種皮膚問題。
皮膚疾病
皮膚作為人體的第一道生理防線和最大的器官，時刻參與著機體的功能活動，維持著機體和自然環(huán)境的對立統(tǒng)一，機體的異常情況也可以在皮膚表面反映出來。皮膚病是影響皮膚的疾病。這些疾病可能導(dǎo)致皮疹、炎癥、瘙癢或其他皮膚變化。有些皮膚病是輕微的，有些會引起嚴重的癥狀。一些最常見的皮膚病包括：痤瘡、黃褐斑、濕疹、牛皮癬、酒渣鼻、白癜風等。許多罕見的皮膚病是遺傳的，包括：光化性癢疹、銀屑病、多汗癥、遺傳性大皰性表皮松懈癥、魚鱗病以及家族性良性慢性天皰瘡等。
某些生活方式因素可能會導(dǎo)致皮膚病的發(fā)生。潛在的健康狀況也會影響皮膚。皮膚病的常見原因包括：毛孔或毛囊被細菌堵塞；影響甲狀腺、腎臟或免疫系統(tǒng)的疾病；接觸環(huán)境誘因，例如過敏原或他人的皮膚；遺傳學(xué)因素；皮膚上的真菌或寄生蟲；藥物，例如治療炎癥性腸病（IBD）的藥物；病毒；糖尿病以及太陽光。
AAV在皮膚組織中的研究
全球每年有30萬人因皮膚創(chuàng)傷而致死，其中絕大部分都是因傷口難以愈合，感染休克而死亡。傷口愈合依賴于基層角質(zhì)細胞，但傷口處往往極度缺失此種細胞。
案例一：AAV在豬皮膚中的表達
本研究通過對小型豬皮內(nèi)注射AAV載體，發(fā)現(xiàn)AAV不僅存在于分裂和有絲分裂后的表皮角質(zhì)形成細胞中，也存在于毛囊上皮細胞和外泌汗腺中，這表明AAV有望進一步利用毛囊靶向和通過皮膚對腫瘤或感染因子進行免疫。
圖1. 皮內(nèi)注射AAVlacZ后的豬皮膚組織切片β-半乳糖苷酶染色
案例二：利用AAV2型載體轉(zhuǎn)導(dǎo)體外構(gòu)建重組皮膚
腺相關(guān)病毒2型（AAV2）是皮膚基因治療的有效載體，因為皮膚是AAV的天然宿主組織，在其中它作為一種自主性細小病毒發(fā)揮作用。
本研究證明攜帶粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、人乳頭瘤病毒E6或綠色熒光蛋白（GFP）轉(zhuǎn)基因的rAAV載體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)離體培養(yǎng)的原代人角質(zhì)形成細胞。通過使用器官型上皮筏培養(yǎng)系統(tǒng)，作者進一步證明，這些轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞可用于形成轉(zhuǎn)基因陽性重組皮膚。
圖2. GM-CSF陽性和陰性皮膚組織切片H&E染色
圖3. AAV/E6/Neo轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生的重組皮膚的免疫組織化學(xué)分析（E6抗體）
AAV載體在皮膚組織中基因治療的應(yīng)用
案例一：通過編碼人血管內(nèi)皮生長因子165（VEGF165）的重組AAV載體促進傷口愈合
人的皮膚由表皮、真皮、皮下組織三層構(gòu)成，當皮膚組織因內(nèi)外源壓力導(dǎo)致離斷或破損，抵抗力下降時，過于薄弱的肌膚屏障就無法抵御外界刺激，創(chuàng)面難愈或不愈的發(fā)生率不斷攀升。傷口愈合是一個非常復(fù)雜的過程，包括炎癥期、增生期、瘢痕形成期和組織再塑等階段。
治療基因的遞送代表了加速難以治療傷口愈合的誘人可能性。實驗證據(jù)表明，在這種情況下，傷口處新生血管生成的增強可能是一個重要的治療靶點。
通過將VEGF165遞送至大鼠的全層切除傷口，能顯著誘導(dǎo)新生血管的形成，從而縮短愈合時間。經(jīng)治療傷口的組織學(xué)檢查也顯示，表皮和真皮的重塑加快，形成了一層厚厚的顆粒層，并包含許多新形成的毛細血管，以及更大管徑的血管。這些數(shù)據(jù)強調(diào)了新血管生成在愈合過程中的重要性，并表明VEGF基因轉(zhuǎn)移可能代表了一種治療傷口愈合障礙的新方法。
圖4. AAV-VEGF165誘導(dǎo)新生血管生成
圖5. AAV-LacZ和AAV-VEGF165對大鼠皮膚創(chuàng)傷的轉(zhuǎn)導(dǎo)（β-半乳糖苷酶染色及VEGF抗體免疫組織化學(xué)分析）
案例二：利用AAV載體將傷口駐留細胞（傷口潰瘍處其他細胞）進行重編程成類干細胞，幫助傷口愈合重新長出新皮膚
基于AAV的體內(nèi)重編程小鼠皮膚模型：間充質(zhì)細胞（紅色）在四種因子的作用下轉(zhuǎn)化為基底角質(zhì)形成細胞（綠色），形成上皮（皮膚）組織
表皮是身體的最外層，多層表皮由基底層1（即基底角質(zhì)形成細胞）內(nèi)的干細胞和祖細胞維持。修復(fù)受損皮膚的一個重要步驟是從鄰近表皮遷移角質(zhì)形成細胞到傷口處以促進再上皮化。對于大傷口，這個過程效率很低。為了改善患者的預(yù)后，必須開發(fā)更快速有效的再生表皮覆蓋方法，最好是非手術(shù)干預(yù)。近年來細胞重編程研究有了迅猛進展，于是作者推斷傷口駐留細胞也可擁有被重新編程為表皮祖細胞的命運，進而產(chǎn)生新的上皮細胞，最終促進皮膚潰瘍表面的從頭上皮化。
而間充質(zhì)細胞參與傷口愈合，于是研究人員最初試圖重編程間充質(zhì)細胞（人真皮成纖維細胞hDFs；脂肪來源基質(zhì)細胞hADSCs），并通過比較人類角質(zhì)形成細胞和原代hDFs的基因表達譜，上游啟動子分析及基因表達逆轉(zhuǎn)分析，作者鑒定出55個轉(zhuǎn)錄因子和31個microRNAs可能與角質(zhì)形成細胞特異性有關(guān)。
然后，通過反復(fù)測試以及對每個潛在的重編程因子進行進一步實驗，最終確定了4個因子（DNP63A、GRHL2、TFAP2A和MYC，簡稱DGTM因子），它們可以介導(dǎo)基底角質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化。其中DNP63A和GRHL2可以將皮膚間充質(zhì)細胞重編程變成皮膚細胞前體；MYC則有助于提高重編程效率，并促進細胞增殖和分層；TFAP2A負責加速小皮膚細胞團塊匯聚集合。為了在體內(nèi)測試DGTM因子，遂選擇使用AAV，但由于AAV不同血清型的細胞向性不同，通過皮下注射或直接應(yīng)用表達綠色熒光蛋白AAV（GFP-AAV）的方式確定哪種AAV有效治療孤立性潰瘍。結(jié)果表明AAVDJ組GFP表達水平最高。
當用AAV遞送上述4個因子局部處理小鼠皮膚潰瘍時，潰瘍處在18天內(nèi)生長出了健康的皮膚（稱之為上皮細胞）。隨著時間的推移，即便潰瘍面很大，這些上皮細胞也能不斷擴大并與周圍皮膚連接，并最終覆蓋整個潰瘍面。3-6個月后，新生成的上皮細胞在多種分子、基因和細胞測試中都表現(xiàn)得如正常皮膚細胞一般。
圖6. DGTM因子通過體內(nèi)重編程生成上皮組織（H&E染色）
三、AAV感染皮膚組織的血清型
研究顯示，衣殼是載體趨向性的主要決定因素。通過使用另一種AAV血清型的衣殼取代AAV2的衣殼，而AAV血清型衣殼的變化可能導(dǎo)致它們獨特的組織趨向性。
通過在小鼠背部皮膚皮下注射，在CAG啟動子下表達eGFP的18種血清型AAV（1E+9GC，100μL），AAVDJ表達的GFP熒光最強[4]。
通過構(gòu)建鼠切除創(chuàng)傷模型，比較AAV2/2和三種假型AAV載體AAV2/5、AAV2/7和AAV2/8對表皮細胞、真皮細胞和肌膜束的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。與AAV2/2相比，AAV2/5和AAV2/8顯著增強表皮和真皮中細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。AAV2/5轉(zhuǎn)導(dǎo)基底和基底上角質(zhì)形成細胞。相反，AAV2/8主要轉(zhuǎn)導(dǎo)基底上的角質(zhì)形成細胞。與AAV2/2相比，AAV2/7和AAV2/8在肌膜束中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高。
圖7. C57BL/6J小鼠創(chuàng)傷后28天的傷口（表皮、真皮、肌膜束）
圖8. AAV2/2與假型載體AAV2/5、AAV2/7和AAV2/8在創(chuàng)傷處轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的比較
四、AAV感染皮膚組織的途徑及劑量
AAV感染皮膚組織的方式主要通過皮內(nèi)注射，也有通過靜脈注射方式感染。
五、皮膚組織損傷中常用的小鼠品系
六、參考文獻
1. Hengge UR, Mirmohammadsadegh A. Adeno-associated virus expresses transgenes in hair follicles and epidermis. Mol Ther. 2000 Sep;2(3):188-94.
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3. Deodato B, Arsic N, Zentilin L, et al. Recombinant AAV vector encoding human VEGF165 enhances wound healing. Gene Ther. 2002 Jun;9(12):777-85.
4. Kurita M, Araoka T, Hishida T, et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 2018 Sep;561(7722):243-247.
5. Keswani SG, Balaji S, Le L, et al. Pseudotyped adeno-associated viral vector tropism and transduction efficiencies in murine wound healing. Wound Repair Regen. 2012 Jul-Aug;20(4):592-600.
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