期刊：Research Article?
影響因子：30.083
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導(dǎo)語(yǔ)
腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)是影響腫瘤進(jìn)展和治療結(jié)果的重要因素。在多種癌癥中，TME亞型與患者對(duì)免疫治療的反應(yīng)相關(guān)。大多數(shù)先前的研究都集中在不同細(xì)胞成分在TME中與免疫治療療效相關(guān)的作用。然而，TME的具體結(jié)構(gòu)及其在免疫治療療效中的作用在很大程度上仍然未知。本文將空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)與單細(xì)胞rna測(cè)序和多重免疫熒光相結(jié)合，鑒定TME中決定抗pd -1治療肝細(xì)胞癌(HCC)患者免疫治療效果的特定空間結(jié)構(gòu)。本文發(fā)現(xiàn)了一個(gè)腫瘤免疫屏障(TIB)結(jié)構(gòu)，一個(gè)由SPP1巨噬細(xì)胞和癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)組成的空間生態(tài)位，位于腫瘤邊界附近，這與免疫檢查點(diǎn)阻斷的有效性有關(guān)。此外，文章剖析了惡性細(xì)胞、SPP1t巨噬細(xì)胞和CAFs之間的配體受體網(wǎng)絡(luò);即缺氧微環(huán)境促進(jìn)SPP1表達(dá)，SPP1巨噬細(xì)胞與CAFs相互作用刺激細(xì)胞外基質(zhì)重塑，促進(jìn)TIB結(jié)構(gòu)形成，從而限制免疫在腫瘤核心的浸潤(rùn)。臨床前，阻斷小鼠SPP1或巨噬細(xì)胞特異性缺失SPP1可增強(qiáng)小鼠肝癌抗pd -1治療的療效，同時(shí)伴有CAF浸潤(rùn)減少和細(xì)胞毒性t細(xì)胞浸潤(rùn)增加。文章發(fā)現(xiàn)SPP1+巨噬細(xì)胞與CAFs相互作用形成的TIB結(jié)構(gòu)與免疫治療效果有關(guān)。因此，通過阻斷SPP1破壞TIB結(jié)構(gòu)可能被認(rèn)為是一種相關(guān)的治療方法，可以增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)阻斷在HCC中的治療效果。
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科學(xué)問題
應(yīng)用多組學(xué)技術(shù)鑒定HCC微環(huán)境中的TIB(腫瘤免疫屏障)結(jié)構(gòu)。
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研究技術(shù)
scRNA-Seq、ST、mIHC（多色熒光免疫組化）
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研究路線圖
圖1
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研究結(jié)果
1.?ST揭示了與免疫治療效果相關(guān)的TIB微環(huán)境結(jié)構(gòu)
文章對(duì)8例接受抗pd -1治療的HCC患者的腫瘤切片進(jìn)行了ST（無應(yīng)答，n = 5；應(yīng)答者，n = 3）和鄰近正常組織切片（n = 3）。患者#1和#5的腫瘤組織與鄰近正常組織配對(duì)(圖1A)。質(zhì)量控制后，根據(jù)無偏聚類和斑點(diǎn)特征，將鄰近正常組織的spot分類為HP和ADH1B高表達(dá)的肝細(xì)胞、RGS5和MYH11高表達(dá)的肌成纖維細(xì)胞/周細(xì)胞、PTPRC、CD3D、CD79A和COL1A1高表達(dá)的免疫/成纖維細(xì)胞或FXYD2和KRT7高表達(dá)的膽管細(xì)胞。腫瘤區(qū)域spot分為肝細(xì)胞、免疫/成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞/周細(xì)胞、表達(dá)SPP1、CD68、LUM和TIMP1的SPP1+巨噬細(xì)胞/CAFs和表達(dá)AFP和APOA2的 惡性肝細(xì)胞（圖2B-G）。
文章發(fā)現(xiàn)SPP1+巨噬細(xì)胞和CAFS共定位于腫瘤區(qū)域周圍，在免疫檢查點(diǎn)治療不響應(yīng)患者中形成一個(gè)免疫屏障結(jié)構(gòu)（圖2C）。此外，mIHC染色顯示，SPP1陽(yáng)性和aSMA 陽(yáng)性細(xì)胞在腫瘤周圍非常接近，ICB無應(yīng)答者的雙陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)數(shù)量明顯高于應(yīng)答者(圖2K-L)，這表明這兩種細(xì)胞類型之間的潛在串串有助于形成與免疫治療效果相關(guān)的TIB結(jié)構(gòu)。
圖2
2.?對(duì)ICB無響應(yīng)的HCC配對(duì)鄰近正常和腫瘤組織的繪制單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜
為了更好地了解ICB無應(yīng)答者中TIB的細(xì)胞組成，文章對(duì)來自6例ICB無應(yīng)答者的HCC腫瘤和鄰近正常組織進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。質(zhì)量控制后對(duì)剩余83,793 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。基于marker基因共定義出六種主要細(xì)胞大類：T/NK細(xì)胞、髓系細(xì)胞、B/漿細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞/雙能細(xì)胞（圖3A,B）。
在所有患者的腫瘤和鄰近正常組織中均可發(fā)現(xiàn)六種主要細(xì)胞類型（圖3C）。其中髓系細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的比例在腫瘤組織中顯著增加（圖3C）。組織、腫瘤和鄰近正常組織之間浸潤(rùn)細(xì)胞類型的差異表明，TME的動(dòng)態(tài)重塑在無反應(yīng)性HCC中起重要作用（圖3D-G）。
圖3
3. 在存在TIB結(jié)構(gòu)的腫瘤區(qū)域中SPP1+巨噬細(xì)胞顯著富集
為了進(jìn)一步探索存在TIB結(jié)構(gòu)的ICB非響應(yīng)患者髓系細(xì)胞異質(zhì)性，文章用類型特異性marker將相鄰正常組織中的3034個(gè)細(xì)胞和腫瘤中的7978個(gè)細(xì)胞分為12個(gè)亞型，包括5種表達(dá)C1QA和CD68的巨噬細(xì)胞亞型（SPP1+巨噬細(xì)胞、FOLR2+巨噬細(xì)胞、CXCL10+巨噬細(xì)胞、CCL3L1+巨噬細(xì)胞、增殖型巨噬細(xì)胞）、表達(dá)CD14的2種單核細(xì)胞亞型（經(jīng)典單核細(xì)胞、促炎單核細(xì)胞）、表達(dá)CSF3R的中性粒細(xì)胞、3種DC亞型（DC1、DC2、漿細(xì)胞樣DCs）和表達(dá)TPSB2的肥大細(xì)胞（圖4A）。
為了驗(yàn)證本文的髓系細(xì)胞聚類的準(zhǔn)確性，本文將此數(shù)據(jù)集與Sharma、張澤民等人的數(shù)據(jù)集進(jìn)行了整合。SPP1+巨噬細(xì)胞與Sharma等人TAM2簇一致，其中SPP1和TREM2表達(dá)水平特別高，這些細(xì)胞在一定程度上與T細(xì)胞相互作用，并與免疫抑制有關(guān)。SPP1+巨噬細(xì)胞是是張澤民數(shù)據(jù)集中MJ –C2-C1QA細(xì)胞簇。FOLR2+巨噬細(xì)胞與Sharma等人的TAM1簇和Zhang等人的MJ -C3-APOE簇相似，與Zhang等人的MJ -C2-C1QA簇重疊。CCL3L1+和CXCL10+巨噬細(xì)胞與Sharma等人的單核細(xì)胞來源細(xì)胞和Zhang等人的MJ - c2 -C1QA簇相似。
攜帶SPP1的細(xì)胞主要分布在TAM2簇，攜帶FOLR2的細(xì)胞位于TAM1簇Sharma等人的數(shù)據(jù)集。但在Zhang等人的數(shù)據(jù)集中，SPP1和FOLR2在MJ -C2-C1QA集群中表達(dá)，MJ -C2-C1QA集群中表達(dá)SPP1和FOLR2的細(xì)胞沒有重疊，這表明SPP1+巨噬細(xì)胞作為一種獨(dú)立的亞型存在，可能在TME中發(fā)揮重要作用。
文章比較了腫瘤和鄰近正常組織之間髓系細(xì)胞亞型的比例（圖4B、C）。SPP1+巨噬細(xì)胞的百分比在腫瘤中顯著增加（圖4C），而漿細(xì)胞樣DC和DC1簇在鄰近正常組織中富集，如先前報(bào)道，腫瘤組織中FOLR2+巨噬細(xì)胞的比例往往高于鄰近正常組織。
4. SPP1+巨噬細(xì)胞與腫瘤進(jìn)展和缺氧微環(huán)境有關(guān)
為了進(jìn)一步探究細(xì)胞亞型和臨床相關(guān)性，本文采用CIBERSORTx 在TCGA-LIHC 大隊(duì)列中評(píng)估48中細(xì)胞類型的免疫浸潤(rùn)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中，與鄰近正常組織相比，腫瘤中SPP1+巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯豐富（圖4D）。流式分選結(jié)果也顯示，無應(yīng)答者腫瘤組織中SPP1+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯高于應(yīng)答者（圖4E）。mIHC多重免疫熒光結(jié)果也顯示CD68與SPP1共定位（圖4F）。
值得注意的是，在三個(gè)獨(dú)立的隊(duì)列中，HCC和SPP1+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)較高的患者的總生存期較短（圖4G）和TCGA-LIHC隊(duì)列(唯一可獲得無進(jìn)展生存信息的隊(duì)列)中較短的無進(jìn)展生存期，而其他巨噬細(xì)胞亞型與患者預(yù)后沒有顯著關(guān)聯(lián)。
文章進(jìn)一步證實(shí)SPP1蛋白在腫瘤組織中特異性表達(dá)增加(在鄰近正常組織中不表達(dá))，并且在HCC腫瘤微陣列中與預(yù)后不良有關(guān)（圖4H-I）。在TCGA-LIHC隊(duì)列中，SPP1+巨噬細(xì)胞的比例在晚期增加（圖4J），表明SPP1+巨噬細(xì)胞可能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。
KEGG富集分析結(jié)果顯示SPP1+巨噬細(xì)胞富集到糖酵解、氧化磷酸化、和HIF-1信號(hào)通路，而其他巨噬細(xì)胞亞型抗原加工提成被顯著富集（圖4K）。體外實(shí)驗(yàn)顯示缺氧可以誘導(dǎo)體外THP-1細(xì)胞中SPP1的高表達(dá)（圖4L），而SPP1+巨噬細(xì)胞的吞噬評(píng)分最低，這表明SPP1+巨噬細(xì)胞確實(shí)受到缺氧的影響，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，抑制吞噬。
圖4
5. CAFs與SPP1+巨噬細(xì)胞之間的相互作用與TIB結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)
為了分析另一種TIB成分CAFs的細(xì)胞組成，我們將腫瘤和鄰近正常組織的scRNA-seq數(shù)據(jù)集中的成纖維細(xì)胞亞簇分成四種亞型（圖5A），包括COL1A1、COL1A2、VCAN和TIMP1表達(dá)的CAFs;表達(dá)SDO3、DSTN、MYH11和CD9的肌成纖維細(xì)胞;周細(xì)胞表達(dá)RGS5和NDUFA4L2;以及表達(dá)COLEC10、CD14和HGF的肝星狀細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAFs主要富集在腫瘤區(qū)域（圖5B）。CIBERSORTx 結(jié)果顯示， 與TCGALIHC隊(duì)列中相鄰正常組織相比，腫瘤樣本中CAFs的浸潤(rùn)比例顯著增加（圖5C）。在ICGC HCC隊(duì)列中，CAFs浸潤(rùn)率較高的患者總體生存期較短（圖5D），提示腫瘤組織中CAFs的富集可能與HCC患者預(yù)后不良有關(guān)。
文章進(jìn)一步基于單細(xì)胞數(shù)據(jù)中SPP1+巨噬細(xì)胞和CAFS top20基因?qū)臻gspot 簇進(jìn)行打分，結(jié)果顯示CAFs與SPP1+巨噬細(xì)胞共定位（圖5E-G），打分值也高于其他簇。SPP1+巨噬細(xì)胞與CAFS在每個(gè)spot點(diǎn)的特征評(píng)分呈顯著正相關(guān)（圖5L），這些結(jié)果表明SPP1+巨噬細(xì)胞和CAFs可能在TIB結(jié)構(gòu)中發(fā)生物理相互作用。
SPP1+巨噬細(xì)胞/CAFs spot上高表達(dá)的基因富集到的通路有助于TIB結(jié)構(gòu)，這些基因在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組織以及細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞底物和細(xì)胞-基質(zhì)粘附中富集（圖5M）。
文章進(jìn)一步通過NicheNet 分析SPP1+巨噬細(xì)胞和CAFs細(xì)胞通訊情況，結(jié)果顯示：SPP1+巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)TGFB1, SPP1和IL1B較高配體活性。TGFB1結(jié)合受體TGFBR1、TGFBR2和TGFBR3在CAFs上表達(dá)，而SPP1與CAFs上的ITGA4、ITGA9、ITGAV、ITGB1和ITGB5結(jié)合, CAFs上IL1B的配體是IL1R1。因此，膠原蛋白(COL1A1, COL1A2, COL3A1，COL4A1和COL5A1)，基質(zhì)金屬蛋白酶(TIMP1和MMP)和趨化因子(CCL3、4、5和CXCR4)靶基因在這些細(xì)胞中表達(dá)。
這些靶點(diǎn)在結(jié)締組織增生反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞外生態(tài)位纖維成分和基質(zhì)金屬蛋白酶，值得注意的是，靶基因的配體與靶之間的相互作用SPP1+巨噬細(xì)胞和caf極有可能屬于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用，ECM通路、TNF信號(hào)通路和IL-17信號(hào)通路（圖5N）。
然后，文章重點(diǎn)研究了前三種配體（TGFB1、SPP1和IL1B）和ECM相關(guān)靶點(diǎn)誘導(dǎo)的信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)HIF1A和FOXO1等調(diào)控子富集于SPP1+巨噬細(xì)胞和CAFs的腫瘤組織中。促進(jìn)ECM形成的靶基因，如TIMP1、LUM、FAP和PSOTN，也在CAFs的腫瘤組織中富集(圖5O)。此外，從scRNA-seq數(shù)據(jù)中獲得的SPP1+成纖維細(xì)胞前20位配體和CAFs前20位受體的平均表達(dá)量在空間集群SPP1+巨噬細(xì)胞/ CAFs中高度富集（圖5P-Q）。這些結(jié)果表明SPP1+巨噬細(xì)胞和CAFs緊密地位于TIB中，并通過這些配體受體相互作用促進(jìn)TIB結(jié)構(gòu)的形成。
圖5
6. TIB結(jié)構(gòu)干擾惡性細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的相互作用，從而限制對(duì)免疫治療的反應(yīng)。
進(jìn)一步看SPP1+ macrophages/CAFs 在TIB結(jié)構(gòu)中重要程度，細(xì)胞通訊結(jié)果顯示，在ICB無應(yīng)答者中，SPP1+巨噬細(xì)胞/CAFs簇與HCC的相互作用權(quán)重最強(qiáng)，但與免疫細(xì)胞的相互作用較弱，而在應(yīng)答者中，SPP1+巨噬細(xì)胞/CAFs、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞與HCC的相互作用權(quán)重相當(dāng)（圖6A、B）。根據(jù)對(duì)已知免疫特征的分析，在ICB無應(yīng)答者中，CD8 T淋巴細(xì)胞（CD3D和CD8A）和細(xì)胞毒性標(biāo)志物（GZMB、GZMK和PRF1）有限或沒有浸潤(rùn)到被TIB結(jié)構(gòu)包圍的腫瘤中（圖6C），而在沒有TIB結(jié)構(gòu)的ICB應(yīng)答者中觀察到免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（圖6D）。
此外，SPP1+巨噬細(xì)胞/CAFs的髓系細(xì)胞免疫抑制特征和ECM特征的特征評(píng)分相對(duì)較高（圖6E），提示SPP1+巨噬細(xì)胞可能與免疫抑制功能有關(guān)，CAFs可能與ECM成分的產(chǎn)生有關(guān)。為了探索SPP1+巨噬細(xì)胞/CAFs在HCC免疫治療中的功能作用，本文計(jì)算了T細(xì)胞炎癥基因表達(dá)譜(GEP)的特征評(píng)分，文章發(fā)現(xiàn)在TIB包裹的HCC組織中GEP評(píng)分較低，并且用于評(píng)估GEP評(píng)分的基因在TIB包膜的HCC組織中并不豐富(圖6F,G)。此外，mIHC染色顯示，SPP1+巨噬細(xì)胞傾向于定位于腫瘤邊界，而CD8+T細(xì)胞定位于ICB無應(yīng)答者的TIB外而不是腫瘤核心(圖6H)，而應(yīng)答者的腫瘤中SPP1+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)較少，CD8 T細(xì)胞浸潤(rùn)較多(圖6I)。綜上所述，這些結(jié)果表明與SPP1+巨噬細(xì)胞相關(guān)的TIB結(jié)構(gòu)的形成可能有助于HCC的免疫抑制微環(huán)境。?
圖6
7. 靶向SPP1可以破壞TIB結(jié)構(gòu)并使HCC對(duì)免疫治療敏感
為了進(jìn)一步驗(yàn)證SPP1的缺失會(huì)消除CAFs對(duì)免疫微環(huán)境的抑制作用，從而使殺傷T細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤核心。本文使用單核細(xì)胞選擇性缺失Spp1的小鼠品系(Spp1fff;Lyz2-Cre)建立腫瘤模型，與Spp1f小鼠相比，抗pd -1治療Lyz2-Cre小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度明顯下降，治療效果較好（圖7A）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，抗pd -1治療顯著增加了Spp1腫瘤區(qū)域的腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞（圖7B）和顆粒酶B CD8+T細(xì)胞（圖7C）的數(shù)量;Lyz2-Cre老鼠。mIHC染色結(jié)果顯示，PD-1后Lyz2-Cre小鼠腫瘤區(qū)域CD8+細(xì)胞上顆粒酶B染色強(qiáng)度高于其他組（圖7D-E）。此外，我們?cè)贖epa 1-6肝腫瘤模型中檢測(cè)了抗spp1和抗pd -1聯(lián)合治療的效果。與SPP1條件敲除小鼠的結(jié)果相似，在攜帶Hepa 1-6腫瘤的免疫正常小鼠中，與單獨(dú)治療相比，聯(lián)合抗SPP1和抗pd -1治療誘導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)減少，顯著提高了應(yīng)答率（圖7F）。抗spp1和抗pd -1聯(lián)合治療也顯著增加了腫瘤區(qū)域顆粒酶B和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量（圖7G-H）。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)在SPP1條件敲除組或抗SPP1處理后，aSMAt成纖維細(xì)胞的表達(dá)下降，抗spp1或抗pd -1治療略微增加了荷瘤GDL小鼠的總生存期，而抗spp1和抗pd -1聯(lián)合治療可顯著提高荷瘤GDL小鼠的總生存期（圖7I）。此外，抗spp1和抗pd -1聯(lián)合治療也顯著降低了aSMA+成纖維細(xì)胞的比例，增加了腫瘤區(qū)域CD8+細(xì)胞的比例（圖7J）。這些結(jié)果表明阻斷SPP1可以增強(qiáng)抗pd -1免疫治療的療效。因此，SPP1可能作為一種有價(jià)值的生物標(biāo)志物，用于預(yù)測(cè)需要免疫治療的HCC患者的預(yù)后，而靶向SPP1可能在未來進(jìn)一步使HCC對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑敏感。
圖7
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結(jié)論
綜上所述，本文的研究整合了單細(xì)胞和ST數(shù)據(jù)，以鑒定和表征HCC TME中與免疫治療療效相關(guān)的TIB結(jié)構(gòu)。文章發(fā)現(xiàn)了SPP1+巨噬細(xì)胞可作為HCC潛在的臨床治療靶點(diǎn)。阻斷這個(gè)靶點(diǎn)會(huì)破壞TIB并促進(jìn)CD8+ T細(xì)胞向腫瘤的浸潤(rùn)。這種新的治療策略，可用于破壞細(xì)胞間相互作用，并可與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用，以提高HCC的治療效果。
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參考文獻(xiàn)：
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