? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ? ? ? ? ?神奇的外泌體
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外泌體概述
外泌體是一種細(xì)胞分泌的微小膜泡，大小為30~150nm的磷脂雙分子結(jié)構(gòu)，可在細(xì)胞間傳遞物質(zhì)和信號(hào)。它在機(jī)體內(nèi)廣泛存在，如外周血、腹水、尿液、唾液、腦脊液等各種體液中。
外泌體攜帶有多種蛋白質(zhì)、脂類、DNA和RNA等重要信息，不僅在細(xì)胞與細(xì)胞間的物質(zhì)和信息傳遞中起重要作用，更有望成為多種疾病的早期診斷標(biāo)志物。
但外泌體所存在的體液環(huán)境復(fù)雜，在尺寸、形態(tài)和生化特性等方面又存在著較大的差異，因此如何能有效地分離出外泌體以供進(jìn)一步研究一直是該領(lǐng)域的難題。
本篇跟大家簡單介紹一下，外泌體提取與純化過程中常用到的一些方法，以及各種方法的特點(diǎn)。
六大提取與純化法
1、差速離心法
差速離心法是最常見的外泌體分離技術(shù)之一。這種方法利用外泌體與其他細(xì)胞器的沉降系數(shù)不同，將細(xì)胞、細(xì)胞碎片以及其他細(xì)胞器等，通過不同離心速度分離出去，從而得到純凈的外泌體。
優(yōu)點(diǎn)：提取方法簡單，提取過程中不會(huì)引入其他的標(biāo)記物，適合大劑量的樣品處理。
缺點(diǎn)：操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作過程中需要超高速離心，且由于離心力的因素，可能會(huì)導(dǎo)致外泌體結(jié)構(gòu)破壞從而對下游實(shí)驗(yàn)造成影響，對于一些具有高粘度的生物樣品（例如血漿和血清樣本），則需要更長的超速離心步驟和更高的離心速度。
2、密度梯度離心法
該方法將超速離心與蔗糖密度梯度相結(jié)合，利用外泌體1.13g/ml-1.21g/ml的密度范圍，實(shí)現(xiàn)外泌體與非囊泡顆粒（如蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)/RNA聚集體等）進(jìn)行分離，從而能夠提取含量低的外泌體。
2018年Li K等人改良了此方案，使用碘克沙醇作為新的一種高效介質(zhì)，外泌體回收率更高、純度更高，并且結(jié)構(gòu)和功能保持更好。
3、聚合物沉降法
這種方法是通過高分子的疏水聚合物（如聚乙二醇（PEG））可以改變外泌體溶解性和分散性的特點(diǎn)，使其能夠在比較低的離心力下沉降出來。其原理可能與疏水聚合物競爭性結(jié)合游離水分子以及疏水聚合物本身形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)。
優(yōu)點(diǎn)：操作起來較為簡單，不需要超速離心機(jī)，得到的外泌體數(shù)量較多，對外泌體理化性質(zhì)影響較小。
缺點(diǎn)：基于聚合物的沉淀方法可能會(huì)同時(shí)分離非囊泡污染物（如脂蛋白等），從而對下游分析造成一定影響。
4、超濾法
這種方法是將溶劑及小分子物質(zhì)過濾到膜的另一側(cè)，而將相對大分子物質(zhì)截留在超濾膜上，以達(dá)到分離的目的。外泌體直徑范圍30～150 nm，利用超濾膜經(jīng)過長時(shí)間的低速離心就可以分離樣本中的外泌體。
優(yōu)點(diǎn)：操作方便，富集效率比較高，易于搭配其他膜或操作，并且成本較低。
缺點(diǎn)：過膜易損耗變形，導(dǎo)致膜堵塞，純度較低，大顆粒蛋白污染嚴(yán)重，并且在洗脫過程中，附著于膜上的外泌體難以回收，導(dǎo)致提取損失。
5、磁珠特異性捕獲法
磁珠特異性捕獲法外泌體表面帶有許多特殊的膜蛋白，如CD9、CD63、CD81等，可將這些外泌體標(biāo)志蛋白作為分離外泌體的特異性標(biāo)記。通過將抗體固定于磁珠等基質(zhì)上，利用抗體與這些標(biāo)志蛋白之間的特異性相互作用，從而得以實(shí)現(xiàn)對外泌體的特異性富集。
優(yōu)點(diǎn)：獲得的外泌體純度較高，并且外泌體膜結(jié)構(gòu)不受太大影響。最近的一項(xiàng)研究已應(yīng)用免疫親和超順磁性納米粒子（ISPN）來結(jié)合外泌體，研究人員通過連接抗CD63抗體和納米粒子生成ISPN，并用它們從體液中分離外泌體。
6、尺寸排阻色譜法
這種方法利用多孔的凝膠球，通過分子大小不同將外泌體純化出來。在分離提取過程中，大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔，很快沿多孔凝膠間的縫隙被流動(dòng)相洗脫出來，而小分子物質(zhì)能進(jìn)入凝膠孔，滯留時(shí)間更長，會(huì)更慢地被洗脫出來。外泌體的分子粒徑大于一般的蛋白分子，所以外泌體會(huì)先被洗脫下來，而粒徑小的蛋白質(zhì)會(huì)被后洗脫下來，從而分離出高純度的外泌體。
優(yōu)點(diǎn)：獲得的外泌體純度相對較高，且外泌體結(jié)構(gòu)不易受到破壞。
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