2025年02月03日，美國(guó)亞利桑那州鳳凰城轉(zhuǎn)化基因組學(xué)研究所生物創(chuàng)新和基因組科學(xué)部發(fā)表了題為“ Spatial transcriptomics identifies molecular niche dysregulation associated with distal lung remodeling in pulmonary fibrosis ”的文章，利用10x Genemics的Xenium及Visium HD平臺(tái)，揭示了與肺纖維化遠(yuǎn)端肺重塑相關(guān)的特征。
該項(xiàng)目利用Xenium及Visium HD可接續(xù)實(shí)驗(yàn)的方案，一張切片完成兩個(gè)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)，真正實(shí)現(xiàn)同一樣本的分子水平和病理水平的共同分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確！
摘要
大規(guī)模的肺泡結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組成的改變是肺纖維化（PF）的標(biāo)志性特征，但導(dǎo)致疾病病理發(fā)展的空間背景仍然不確定。通過(guò)基于圖像的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，對(duì)35個(gè)獨(dú)特肺部的160萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行了分析。表征了肺纖維化相關(guān)細(xì)胞類(lèi)型的定位，確立了經(jīng)典PF組織病理學(xué)特征的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)，并在正常和PF肺中識(shí)別出控制和空間特異性分子定義的各種不同分子特性的區(qū)域。利用機(jī)器學(xué)習(xí)和軌跡分析對(duì)重塑?chē)?yán)重程度梯度上的空腔進(jìn)行分割和排名，我們識(shí)別出了與漸進(jìn)性肺部病理相關(guān)的組成性和分子性變化，始于肺泡上皮調(diào)節(jié)異常，并以巨噬細(xì)胞極化的變化為終點(diǎn)。這些結(jié)果一并提供了對(duì)PF的獨(dú)特空間解析視角，并確立了可以應(yīng)用于其他空間轉(zhuǎn)錄組研究的方法。
樣本收集
9例對(duì)照樣本和26例疾病樣本制成組織芯片（TMA）
Xenium探針共343 genes
肺組織固定panel（早期版本：246 genes）+定制panel（97 genes）
技術(shù)
Xenium、Visium HD（同一張樣本Xenium下機(jī)后繼續(xù)做Visium HD，真正實(shí)現(xiàn)同一樣本共同分析）
研究思路圖
分析工具
GraphSAGE、Seurat v5
GraphSAGE作為一種圖神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，能夠有效捕捉轉(zhuǎn)錄本之間的局部鄰域信息，從而定義出新的嵌入空間，為后續(xù)聚類(lèi)分析提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
Seurat v5則是一種廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析的強(qiáng)大工具，它通過(guò)基于空間位置和細(xì)胞類(lèi)型的局部鄰域構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞群體的高效聚類(lèi)。這兩種工具的結(jié)合使用，極大地提升了數(shù)據(jù)解析的準(zhǔn)確性和效率。
1. 肺細(xì)胞多樣化
共鑒定了 47 種細(xì)胞類(lèi)型，更好地反映了疾病狀態(tài)下肺的細(xì)胞組成。空間數(shù)據(jù)使我們能夠識(shí)別成纖維細(xì)胞亞型，包括廣泛分散于肺部的肺泡成纖維細(xì)胞、傳導(dǎo)氣道和肺泡管周?chē)募〕衫w維細(xì)胞、斑塊狀病灶中的“纖維化”活化成纖維細(xì)胞和毗鄰胸膜表面間皮細(xì)胞的“胸膜下”成纖維細(xì)胞。后續(xù)分析，比較了不同分類(lèi)名稱(chēng)之間以及“病理百分比”定量指標(biāo)之間的細(xì)胞和分子變化，并根據(jù)臨床醫(yī)生的注釋描述了 27 種特定的 PF 組織病理學(xué)特征。
2. 生態(tài)位分析揭示疾病引發(fā)的細(xì)胞相互作用
作者開(kāi)發(fā)了一種新方法，通過(guò)直接使用轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)來(lái)識(shí)別與細(xì)胞分配無(wú)關(guān)的生態(tài)位。使用 GraphSAGE，根據(jù)轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)的空間位置訓(xùn)練了一個(gè)圖神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，以聚合局部鄰域信息并定義一個(gè)嵌入空間，該嵌入空間為數(shù)據(jù)集中的所有單個(gè)轉(zhuǎn)錄本提供新的表示。然后，應(yīng)用Gaussian mixture models對(duì)嵌入空間中的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類(lèi)并識(shí)別生態(tài)位，使用共識(shí)方法將細(xì)胞分配到這些生態(tài)位。在這兩種分析中，確定了 12 個(gè)生態(tài)位，它們顯示出不同的基因表達(dá)特征和細(xì)胞類(lèi)型組成。例如氣道微環(huán)境 C1 和 T7 以及淋巴微環(huán)境 T2 和 C9 分別描述了特定氣道和淋巴細(xì)胞類(lèi)型之間的緊密空間關(guān)系。微環(huán)境還捕捉了不同譜系細(xì)胞之間更復(fù)雜的關(guān)系，包括“健康”肺泡微環(huán)境（T4；C8），其中包括 AT1、AT2、毛細(xì)血管細(xì)胞和肺泡成纖維細(xì)胞等細(xì)胞類(lèi)型。并且在生態(tài)位分析的指導(dǎo)下，我們?cè)诟鄻颖局邪l(fā)現(xiàn)了表現(xiàn)出上皮脫離的其他區(qū)域。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)直接從分子數(shù)據(jù)中識(shí)別特定疾病相關(guān)病理特征的潛力。
3. 疾病引起的巨噬細(xì)胞在肺泡中聚集
在Xenium數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，與氣腔積聚相關(guān)的巨噬細(xì)胞似乎包括兩個(gè)截然不同的群體，一個(gè)主要以 FABP4 為標(biāo)志物，另一個(gè)以 SPP1 為標(biāo)志物。肺泡內(nèi) FABP4+（肺泡）巨噬細(xì)胞群和間質(zhì)中 SPP1+巨噬細(xì)胞群較少。盡管在氣腔內(nèi)積聚，但 FABP4+巨噬細(xì)胞在受影響較小的樣本中占巨噬細(xì)胞總數(shù)的比例僅略有增加，并且隨著病理百分比的增加而減少。在對(duì)照肺中觀察到 SPP1+巨噬細(xì)胞，但在受影響較多的樣本中占總巨噬細(xì)胞群的比例更高，并且 SPP1表達(dá)增加與更高的病理評(píng)分相關(guān)，這表明巨噬細(xì)胞表型的進(jìn)化是進(jìn)行性 PF 的特征。在相同樣本的 Visium HD 數(shù)據(jù)也證實(shí)了遠(yuǎn)端氣腔中存在 FABP4+和混合 FABP4+/SPP1+積聚。
4. 細(xì)胞重塑時(shí)間表
利用一種機(jī)器學(xué)習(xí)方法，根據(jù)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的空間模式識(shí)別和分割樣本中的管腔，使用譜聚類(lèi)將表達(dá)變化分為以下四大類(lèi)：穩(wěn)態(tài)和早期、中期和重塑晚期。主要揭示了從健康到嚴(yán)重纖維化的分子和細(xì)胞變化的順序，初始肺泡重塑是由肺泡毛細(xì)血管界面的破壞和上皮中再生相關(guān)程序的激活所驅(qū)動(dòng)，隨后是上皮下成纖維細(xì)胞的激活，然后是髓樣細(xì)胞募集/增殖。
通過(guò)Xenium和Visium HD兩種技術(shù)揭示了KRT5−/KRT17+細(xì)胞的脫落現(xiàn)象及其與周?chē)?xì)胞的關(guān)系，這是以往單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)難以捕捉到的現(xiàn)象。研究還通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)和軌跡分析，系統(tǒng)地解析了不同病理階段的分子特征，為理解肺纖維化的分子演變提供了全新的視角，強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞異質(zhì)性和空間分布對(duì)疾病進(jìn)展的重要影響，提示未來(lái)研究應(yīng)更加關(guān)注這些因素在疾病發(fā)展中的作用。