大鼠血管生成素Ⅱ（Ang Ⅱ）檢測(cè)試劑盒（ELISA）方法
使用說(shuō)明書(shū)
僅供科研使用，不得用于醫(yī)學(xué)診斷。
使用前仔細(xì)閱讀本說(shuō)明書(shū)。
用 途： 用于定量檢測(cè)大鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中血管生成素Ⅱ（Ang Ⅱ）的含量。
工作原理
本試劑盒采用雙位點(diǎn)夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），測(cè)定樣品中大鼠血管生成素Ⅱ（Ang Ⅱ）的水平。向預(yù)先包被大鼠血管生成素Ⅱ（Ang Ⅱ）抗體的酶標(biāo)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本和HRP標(biāo)記的血管生成素Ⅱ（Ang Ⅱ）抗體，經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的組分，然后再加入底物A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中大鼠血管生成素Ⅱ（Ang Ⅱ）的濃度呈正相關(guān)。
需要而未提供的試劑和器材
1．37℃恒溫箱。
2．標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。
3．精密移液器及一次性吸頭
4．蒸餾水，
5．一次性試管
6．吸水紙
注意事項(xiàng)
1．從2-8℃取出的試劑盒，在開(kāi)啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差
3．建議所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣本都做雙份檢測(cè)。
4．嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
5．為避免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜。
6．不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
7．底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。
操作步驟
1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為1800ng/L，1200ng/L ，600ng/L，300ng/L， 150ng/L）。
2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。
3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4.配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。
5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。
7.溫育：操作同3。
8.洗滌：操作同5。
9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
11.測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。
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