?描述：
新鮮/冷凍組織胞質(zhì)胞核分離試劑盒從細(xì)胞和組織中分離細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核組分是一種常見的實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞樣品的組分分離相對(duì)簡(jiǎn)單直接，然而，?從組織樣品中特別是冷凍組織中將胞質(zhì)和胞核組分分離干凈是很具挑戰(zhàn)的。因?yàn)槔鋬龊头磸?fù)凍融會(huì)引起組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變，加之不適當(dāng)?shù)膭驖{方式和效率低的提取緩沖液，使得交叉污染十分嚴(yán)重。目前大多數(shù)商業(yè)試劑盒設(shè)計(jì)可同時(shí)用于細(xì)胞和組織樣品，但是忽略了兩種類型樣品之間的結(jié)構(gòu)差異。因此，從新鮮/冷凍組織中分離胞質(zhì)和胞核組分時(shí)，交叉污染問題無(wú)法避免(見下文參考文獻(xiàn)?1?和?2)。這款新型的胞質(zhì)和胞核分離試劑盒專用于組織樣品的胞質(zhì)胞核分離，試劑盒特有的緩沖液體系和獨(dú)特的操作方法可以將交叉污染降到最低。整個(gè)操作可以在?30?分鐘內(nèi)完成。
應(yīng)用：
可應(yīng)用于?SDS-PAGE，immunoblottings，ELISA，IP，蛋白定位，凝膠遷移分析，2-D?等其他應(yīng)用。
試劑盒組分：
- 緩沖液A?25ml
- 緩沖液B?10ml
- 緩沖液D?1.5ml
- 緩沖液N?1.5ml 5.1.5ml?離心管?40?個(gè)6.1.5ml?研磨杵?2?個(gè)7.蛋白質(zhì)提取粉?2?克
運(yùn)輸：常溫運(yùn)輸儲(chǔ)存：4?度保存
重要產(chǎn)品信息：
- 實(shí)驗(yàn)開始前將緩沖液A?和緩沖液B?冰上預(yù)冷。
- 所有的離心步驟請(qǐng)?jiān)?/font>?4?度環(huán)境或?4?度冷凍離心機(jī)離心。
- 使用前推薦將蛋白酶抑制劑加入分裝的緩沖液A?中。
- 研究蛋白磷酸化，磷酸酶抑制劑應(yīng)在使用前加入到分裝的緩沖液?A?和緩沖液?B ?中。
- 推薦使用BCA?法測(cè)定蛋白濃度。
- 當(dāng)室溫低于?20?度時(shí)緩沖液D?中可能出現(xiàn)白色沉淀，使用前可將緩沖液?D?在?37?度水浴鍋加熱溶解沉淀。
操作方法：
1、?取?20-30mg?新鮮或冷凍組織樣品，放入試劑盒提供的?1.5ml?離心管中，加入?250ul?緩沖液A?覆蓋組織，?冰上孵育?5?分鐘。使用提供的研磨杵輕輕的扭轉(zhuǎn)研磨樣品?1?分鐘（40-60?次）。研磨杵可以重復(fù)使用，?用清水清潔后，用紙巾擦干即可。
2、?14000 X?g，離心?5?分鐘。轉(zhuǎn)移?200μl?上清液(胞質(zhì)組分)到新的自備的離心管中保存。(如果上清液不夠澄清,?14000 X g，再離?5?分鐘進(jìn)一步澄清)。如上所述用研磨杵再次把沉淀進(jìn)一步研磨?(研磨?60-100?次)。研磨杵放置于管中，加入?0.8 ml?緩沖液?A?到管中。再研磨幾次，拿出研磨杵。用?1?毫升吸頭上下吹打15-20?次混勻。在冰上孵育?5-8?分鐘，讓大的組織碎片通過重力作用沉到底部，將?0.7 ml?的上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的試劑盒提供的?1.5 ml ?管中(盡量避免管底大的組織碎片)。
3、?500xg，離心?2?min，棄去上清液。加入?0.5 ml?的緩沖液B，渦旋振蕩?10-20?秒重懸沉淀。冰上孵育?5?分鐘，?2000 X g?離心?2?分鐘，完全去除上清液。
4、?沉淀是分離的細(xì)胞核，根據(jù)不同的下游應(yīng)用有兩種核蛋白提取方式可選：
A?.變性核蛋白提取（提取出的核蛋白適用于?SDS-PAGE、Western?blotting?等應(yīng)用）
用?50μl??緩沖液?D??重懸沉淀(懸液可能粘稠，這是正常的)。稱取?50-60??毫克的蛋白提取粉，加入沉淀(盡量避免接觸管壁)。用研磨杵扭轉(zhuǎn)研磨約?60-100?次。研磨杵仍置于離心管中，加入?50?-150ul?的緩沖液A?到管中，再研磨幾次(使用緩沖液A?的多少取決于沉淀的大小。研磨杵可以重復(fù)使用，用清水清潔后，用紙巾擦干即可
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