?一、 全基因組甲基化測序概述?
?
全基因組甲基化測序結(jié)合了亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化（bisulfite conversion）方法與新一代高通量測序技術(shù)，可在單堿基分辨率水平上高效地檢測全基因組DNA甲基化狀態(tài)。亞硫酸氫鹽處理可以使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，PCR擴(kuò)增所需片段，則尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶。對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，與參考序列比對，即可判斷CpG/CHG/CHH位點是否發(fā)生甲基化。
二、 全基因組甲基化測序研究內(nèi)容
全基因組甲基化圖譜（DNA methylation profiling）及單樣品高低甲基化位點在基因組不同區(qū)域的分布：全基因組甲基化測序可全面、精確地檢測全基因組DNA甲基化狀態(tài)，為更深入的表觀遺傳調(diào)控分析奠定基礎(chǔ)。在全基因組甲基化圖譜的基礎(chǔ)上，對基因組不同染色體、不同基因區(qū)域、不同序列環(huán)境、不同基因功能元件如啟動子、外顯子、內(nèi)含子、UTR區(qū)的胞嘧啶甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析，有助于從多個角度研究基因的功能及調(diào)控。
研究流程示例
多樣品間的差異性甲基化區(qū)域（DMR）分析：全基因組甲基化測序不但可使研究者在基因組規(guī)模洞察不同生物之間在DNA 甲基化水平和模式上的差異, 也可用于研究同一物種多個樣品間的差異性甲基化區(qū)域（differentially methylated regions DMRs）。
基因組的甲基化狀態(tài)具有一定的時空特異性。對某一物種，不同的環(huán)境、不同的發(fā)育階段、不同類型的樣品（細(xì)胞、組織、個體）所反映的甲基化狀態(tài)可能是不同的，存在著差異性甲基化區(qū)域。其中有些是與基因調(diào)控有關(guān)的功能區(qū)域。鑒定、分析這些區(qū)域及其所在的基因或CpG島，對發(fā)育和腫瘤等生命過程研究有一定意義。
研究流程示例
三、 全基因組甲基化測序?qū)嶒灱夹g(shù)路線
全基因組甲基化測序?qū)嶒灹鞒?/strong>
四、 全基因組甲基化測序樣品要求（基因組DNA）
樣品純度：OD 260/280值應(yīng)在1.8～2.0 之間； RNA 應(yīng)去除干凈；
樣品濃度：最低濃度不低于50ng/μl；
樣品總量：每個樣品總量不少于15μg；
樣品溶劑：應(yīng)溶解在H20或TE (pH 8.0)中；
樣品運輸：DNA低溫運輸（-20℃）；在運輸過程中用parafilm將管口密封好，以防出現(xiàn)污染。
五、全基因組甲基化測序數(shù)據(jù)分析技術(shù)路線
六、全基因組甲基化測序數(shù)據(jù)分析內(nèi)容
1. 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制?
包括：總reads數(shù)、總base數(shù)，Q20比例、Q20位點分布圖、堿基分布圖。
2. 測序數(shù)據(jù)預(yù)處理?
包括：去除總體質(zhì)量偏低的reads，將質(zhì)量大于20堿基所占比例小于50%的reads去除；去除3’端質(zhì)量Q低于20的堿基；去除reads中所含有的接頭序列；去除長度小于20的測序片段(reads)，去除含有低質(zhì)量N堿基的reads。
3. 轉(zhuǎn)化效率評估?
使用lamda噬菌體基因組作為內(nèi)參，評價BS轉(zhuǎn)化效率。
4. 全基因組比對和mapping率統(tǒng)計
使用bismark軟件將預(yù)處理后的reads比對到基因組，統(tǒng)計mapping率、樣本整體甲基化水平，每個CpG\CHG\CHH位點的測序深度和甲基化比例。
5. CpG島區(qū)域、啟動子區(qū)域及整個基因組的覆蓋及不同深度關(guān)系
6. CpG/CHG/CHH位點覆蓋率、測序深度、甲基化比例和染色體分布
1) CpG/CHG/CHH位點測序深度
2) CpG/CHG/CHH位點甲基化比例
3) CpG/CHG/CHH位點染色體分布
4) 高甲基化位點（甲基化比例>70%）和低甲基化位點（甲基化比例<30%）的基因功能區(qū)分布。
5) 甲基化程度（%）對于基因的不同功能區(qū)域的分布。
6) 甲基化程度（%）對于基因本體和上下游區(qū)域的分布。
7) 甲基化程度（%）對于CpG island,shore和shelf區(qū)域的分布。
?
7. 差異甲基化位點和區(qū)段篩選
使用fisher檢驗篩選差異甲基化CpG/CHG/CHH位點和甲基化區(qū)段。
8. 基因promoter、TSS、gene body區(qū)域甲基化水平計算和篩選
根據(jù)已有基因注釋，計算基因的promoter、TSS、gene body等區(qū)域的甲基化情況，并據(jù)此篩選差異甲基化的基因。
9. 差異甲基化位點或區(qū)段的CpG島注釋和基因注釋
1) 差異甲基化位點或區(qū)段CpG島分布
2) 差異甲基化位點或區(qū)段不同基因功能元件分布
3) 差異甲基化位點或區(qū)段染色體分布
10. 全基因組甲基化圖譜
?
11. 甲基化和表達(dá)譜數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析
將甲基化數(shù)據(jù)和表達(dá)譜數(shù)據(jù)結(jié)合分析，將基因的差異甲基化和差異表達(dá)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，可進(jìn)行差異基因的甲基化情況聚類熱圖、不同基因區(qū)域甲基化和表達(dá)譜相關(guān)性計算和作圖。
12. GO和KEGG等功能分析和作圖
13. 客戶定制分析
可根據(jù)客戶的研究需求，協(xié)商定制個性化分析內(nèi)容
甲基化測序應(yīng)用案例
?
- 全基因組甲基化測序揭示蠶基因組稀疏的甲基化
?
昆蟲的表觀遺傳學(xué)調(diào)控可以反映其多樣的生物反應(yīng)過程，本研究采用Illumina高通量亞硫酸鹽測序，檢測了模式生物蠶在單堿基水平的甲基化情況。保守估計，基因組中0.11%的胞嘧啶被甲基化，且可能全部存在于CG二核苷酸中。基因區(qū)域CG甲基化是非常豐富的，這可能與基因表達(dá)水平相關(guān)，同時也暗示了甲基化在基因轉(zhuǎn)錄中扮演了一個正面的角色。研究人員發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄元素、啟動子及核糖體DNAs低甲基化，相反，基因區(qū)域與基因座匹配的小RNAs被充分甲基化。該研究有助于我們對于昆蟲表觀遺傳的理解。
原文：Single base–resolution methylome of the silkworm reveals a sparse epigenomic map. Nature Biotechnology.2010,28:216-20.