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一、細(xì)胞培養(yǎng)常見問題解答

1、如何選用培養(yǎng)基？

選擇培養(yǎng)基沒有一定標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考：

（1）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基。可以查閱文獻(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時(shí)咨詢。

（2）實(shí)驗(yàn)單位慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。

（3）根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇培養(yǎng)基。如貼壁細(xì)胞培養(yǎng)多選DMEM；進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)多用RPMI1640。

（4）用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，可以用生長(zhǎng)曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。

2、solarbio常見培養(yǎng)基的添加成分？

（1）12100?DMEM高糖培養(yǎng)基：葡萄糖4.5g/L,含谷氨酰胺，HEPES，青霉素、鏈霉素，碳酸氫鈉和酚紅。不含丙酮酸鈉

（2）31600?DMEM低糖培養(yǎng)基：葡萄糖1.0g/L,含谷氨酰胺，HEPES，青霉素、鏈霉素，丙酮酸鈉，碳酸氫鈉和酚紅

（3）31800?RPMI?1640培養(yǎng)基：含**鈣，谷氨酰胺，HEPES，青霉素、鏈霉素，碳酸氫鈉和酚紅，不含丙酮酸鈉

（4）90013?DMEM高糖培養(yǎng)基：葡萄糖4.5g/L,含碳酸氫鈉，不含谷氨酰胺，HEPES，青霉素、鏈霉素，丙酮酸鈉和酚紅。

（5）90022?RPMI?1640培養(yǎng)基：不含谷氨酰胺，HEPES，青霉素、鏈霉素，丙酮酸鈉和酚紅。

3、L－谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中的作用？穩(wěn)定性如何？

合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要。?L－谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源，參與蛋白質(zhì)合成和核酸代謝。

L－谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定，在配制各種培養(yǎng)液中都會(huì)補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。谷氨酰胺溶液應(yīng)置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新補(bǔ)加谷氨酰胺。

4、培養(yǎng)基或緩沖液中酚紅的作用是什么？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為pH值的指示劑，中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)偏黃色，堿性時(shí)顯紫色。

研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素），為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)?胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。?????

5、在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，有效期是多長(zhǎng)？

如果在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，建議在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。

6、細(xì)胞培養(yǎng)基中碳酸氫鈉以及HEPES作用？

培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)，并采用開放培養(yǎng)，使細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2及時(shí)溢出培養(yǎng)瓶，再通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO2濃度，與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值。

HEPES是一種非離子兩性緩沖劑,?對(duì)細(xì)胞無毒性作用，在pH?7.2～7.4范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力，能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的pH范圍。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2環(huán)境，CO2逸出，pH迅速升高，若培養(yǎng)基中含有HEPES，可維持pH7.0左右。一般進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES。使用終濃度為10～50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。

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7、配置的培養(yǎng)基顏色變紫紅色或者偏黃是什么原因？

配好的培養(yǎng)液變堿（變紫紅）是正常的現(xiàn)象。暴露在空氣中的培養(yǎng)液，因?yàn)榇髿庵卸趸嫉臐舛群艿停囵B(yǎng)液中的HCO3?-被漸漸耗掉，培養(yǎng)液的pH值也逐漸升高，變成了紫紅色。如果培養(yǎng)基pH值偏堿的程度不大，可將裝培養(yǎng)液的瓶口擰松，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中一段時(shí)間，讓培養(yǎng)箱中的CO2進(jìn)入培養(yǎng)液，pH值就可以糾正。如果pH值偏離的程度很大，可以通過添加少量無菌的H?Cl?或者NaOH調(diào)節(jié)pH，便可以使用。

有時(shí)在加入血清后培養(yǎng)基顏色會(huì)發(fā)黃，加入血清后培養(yǎng)基PH會(huì)稍微下降，有個(gè)別批次的血清，可能發(fā)生過溶血因此色素比較高，加血清后培養(yǎng)液會(huì)變黃色。培養(yǎng)液寧酸勿堿，一般對(duì)細(xì)胞影響不大，可正常使用。偏離程度大者可自行調(diào)節(jié)pH。

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8，使用胰蛋白酶時(shí)加入?E?DTA的目的是什么？

胰蛋白酶能消化細(xì)胞-細(xì)胞，細(xì)胞-基質(zhì)之間得連接從而使細(xì)胞從培養(yǎng)板上脫落下來并使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞。鈣鎂離子是保持細(xì)胞和細(xì)胞之間相互連接所必需的，也是胰蛋白酶抑制劑，EDTA可以螯合鈣鎂離子，保持抑制胰蛋白酶的活性，有助于消化細(xì)胞。

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9，細(xì)胞培養(yǎng)中的添加劑可以用DMSO和乙醇等有機(jī)溶劑配置嗎？

在細(xì)胞培養(yǎng)中常常需要加入一些特定的添加劑或藥物，這些試劑水溶性低，不能充分溶解，需要根據(jù)產(chǎn)品使用說明用DMSO或者無水乙醇來配置高濃度儲(chǔ)存液。用DMSO和乙醇作為細(xì)胞培養(yǎng)添加劑的溶劑時(shí)要考慮到細(xì)胞的耐受性，一般培養(yǎng)基中要求其濃度不超過0.1%。

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10、細(xì)胞培養(yǎng)污染如何讓預(yù)防？

溶液處理，復(fù)蘇或重新購置細(xì)胞，再培養(yǎng)。若污染細(xì)胞價(jià)值較大，又難于重新得到，可采用5～10?倍于常用量的抗生素沖擊，加入高濃度抗生素后作用24～48h，再換入常規(guī)培養(yǎng)液，有時(shí)可能奏效。細(xì)胞培養(yǎng)中常用的抗生素及用量見下表。?

?????????????????????????????????????????????????????????????常用抗生素用量和效應(yīng)??????????