CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是一種新型DNA-蛋白互作研究技術(shù)，主要用于研究轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾在全基因組上的結(jié)合位點(diǎn)。CUT&Tag的核心原理是利用抗體識別目標(biāo)蛋白或特定的染色質(zhì)修飾標(biāo)記，并通過蛋白酶Tn5轉(zhuǎn)座酶（Tagmentase）在目標(biāo)位點(diǎn)上進(jìn)行高效的DNA片段化和文庫構(gòu)建。Stephen Henikoff團(tuán)隊(duì)于2019年研發(fā)了CUT&Tag，作為ChIP-Seq（免疫共沉淀測序）的改進(jìn)和替代方法。CUT&Tag技術(shù)憑借其高靈敏度、低背景噪音和低細(xì)胞量需求，已成為揭示基因調(diào)控機(jī)制、解析染色質(zhì)狀態(tài)和推動精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究的重要工具，并廣泛應(yīng)用于表觀遺傳學(xué)研究、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析、疾病機(jī)制解析、藥物篩選與作用機(jī)制探索以及單細(xì)胞水平的基因調(diào)控研究等多領(lǐng)域。依托先進(jìn)的Protein A/G-Tn5融合蛋白體系和高通量測序平臺，百泰派克生物科技提供專業(yè)的CUT&Tag技術(shù)服務(wù)，覆蓋樣本制備、文庫構(gòu)建、高通量測序及生物信息學(xué)分析全流程。我們的技術(shù)團(tuán)隊(duì)具備豐富的表觀基因組學(xué)經(jīng)驗(yàn)，能夠高效、精準(zhǔn)地解析蛋白質(zhì)與DNA的相互作用，助力科研人員揭示基因調(diào)控的深層機(jī)制。
一、CUT&Tag技術(shù)背景
組蛋白通過形成核小體壓實(shí)和保護(hù)DNA，其修飾（如乙酰化、甲基化）與DNA甲基化共同調(diào)控基因表達(dá)，其修飾狀態(tài)和動態(tài)變化對于細(xì)胞功能的維持至關(guān)重要，也與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，理解組蛋白與 DNA 之間復(fù)雜而精密的相互作用，對于揭示正常細(xì)胞過程和疾病狀態(tài)，尤其是癌癥，具有重要的科學(xué)和臨床意義。此外，蛋白質(zhì)-DNA相互作用是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的核心，也是啟動基因轉(zhuǎn)錄的前提。為了研究這些復(fù)雜的相互作用機(jī)制，科學(xué)家開發(fā)了多種方法，包括凝膠阻滯、DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)、甲基化干擾、體內(nèi)足跡、酵母雙雜交、ChIP-Seq 和 CUT&Tag 等。其中，CUT&Tag技術(shù)正逐步成為研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用和染色質(zhì)狀態(tài)的前沿。
二、CUT&Tag與ChIP-Seq技術(shù)比對
CHIP-seq（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP），結(jié)合位點(diǎn)分析法/染色質(zhì)免疫共沉淀，其原理是通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，并對其進(jìn)行純化與文庫構(gòu)建；然后對富集得到的DNA片段進(jìn)行高通量測序。通過將獲得的數(shù)百萬條序列精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。然而，該技術(shù)存在細(xì)胞起始量要求高、容易出現(xiàn)假陰性/假陽性、超聲打斷條件難以選擇、高度依賴特異性抗體、重復(fù)性差、信噪比低等缺陷。
CUT&Tag使用ProteinA/G-Tn5融合蛋白直接結(jié)合目標(biāo)蛋白，免除了傳統(tǒng)方法的交聯(lián)步驟，大幅降低背景噪聲，并實(shí)現(xiàn)高分辨率的結(jié)合位點(diǎn)檢測。CUT&Tag技術(shù)流程包括以下關(guān)鍵步驟：首先，使用ConA磁珠結(jié)合細(xì)胞膜上的糖蛋白，提取細(xì)胞核或直接利用核樣本，同時通過洋地黃皂苷（digitonin）透化細(xì)胞膜，增強(qiáng)核膜通透性。接著，加入特異性一抗（如α-H3K27me3）孵育并洗滌去除非特異性結(jié)合，再加入二抗確保抗體復(fù)合物精準(zhǔn)結(jié)合靶標(biāo)區(qū)域。隨后，Protein A/G-Tn5融合蛋白與抗體復(fù)合物結(jié)合，將Tn5轉(zhuǎn)座酶精準(zhǔn)定位到目標(biāo)DNA區(qū)域。通過加入含Mg²?的反應(yīng)液激活Tn5酶，實(shí)現(xiàn)DNA片段化并插入測序接頭，完成文庫構(gòu)建。最終，利用Illumina平臺進(jìn)行高通量測序，結(jié)合生物信息學(xué)工具進(jìn)行質(zhì)控、基因組比對、富集峰注釋、Motif識別、GO功能分析及KEGG通路分析，全面解析轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及染色質(zhì)修飾的功能作用。
圖1. 技術(shù)路線比對 Plant Methods 16, 120 (2020)
圖2
三、CUT&Tag技術(shù)亮點(diǎn)
1、低細(xì)胞量需求：僅需少量細(xì)胞（甚至單細(xì)胞水平）即可進(jìn)行分析。
2、高靈敏度：背景噪聲低，信噪比高。
3、高分辨率：可清晰定位到轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾的結(jié)合區(qū)域
4、實(shí)驗(yàn)周期短：相較于ChIP-Seq，實(shí)驗(yàn)流程更加簡單，時間更短。
四、CUT&Tag文獻(xiàn)應(yīng)用
——CUT&Tag揭示H3K18la對PDAC（胰腺導(dǎo)管腺癌）發(fā)生發(fā)展調(diào)控機(jī)制
圖3
胰腺癌是一種高度侵襲性的消化系統(tǒng)腫瘤，是人類最致命的惡性腫瘤，5年總生存率較低，其中80%以上為胰腺導(dǎo)管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma， PDAC）。盡管在過去十年中試圖改善其治療，但PDAC的死亡率并沒有大幅下降。因此，更清晰地了解PDAC的生長和轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找潛在的治療靶點(diǎn)和新的生物標(biāo)志物來預(yù)測PDAC的預(yù)后勢在必行。PDAC細(xì)胞利用“代謝重編程”來支持惡性行為，如快速增殖、侵襲和一些細(xì)胞過程。糖酵解增強(qiáng)和乳酸積累是各種類型癌癥的共同特征。然而，代謝重編程如何重塑表觀遺傳改變，特別是PDAC中的乳酸化，仍不清楚。為此，北京大學(xué)第三醫(yī)院利用CUT&Tag技術(shù)展開研究并發(fā)表“糖酵解和組蛋白乳酸化之間的正反饋調(diào)節(jié)驅(qū)動胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生”一文，闡述了其主要研究成果：
1、組蛋白乳酸化水平升高與PDAC患者的不良預(yù)后相關(guān)
（1）在PDAC患者胰腺組織中，乳酸含量高于正常鄰近組織（圖A）。同樣，MIA PaCa-2、PANC-1、AsPC-1和PL45等PDAC細(xì)胞系的乳酸產(chǎn)量也高于人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系hTERT-HPNE（圖B）。使用非靶向代謝組學(xué)分析了PDAC患者和健康組血清樣本中代謝物的變化。結(jié)果顯示，腫瘤組和健康組之間有222種代謝物存在顯著差異，腫瘤組中有100種代謝物較低，122種代謝物較高，圖C)。不同血清代謝物的KEGG分析顯示中心碳代謝富集（圖D）。尤其值得注意的是，乳酸也是代謝產(chǎn)物之一。
（2）由于產(chǎn)生大量乳酸作為組蛋白乳酸化的底物，檢測了5對PDAC組織和周圍非癌組織的蛋白質(zhì)乳酸化水平。在PDAC組織中觀察到更高水平的全局/泛賴氨酸乳酸化（Pan Kla）（圖E）。由于組蛋白修飾在大多數(shù)生物學(xué)過程中發(fā)揮著基礎(chǔ)作用，H3K18la已被報道調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，如腫瘤發(fā)生，因此重點(diǎn)研究了其表達(dá)和功能。一致地，H3K18la水平在PDAC組織中也升高（圖E）。此外，與正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系相比，4種PDAC細(xì)胞系中Pan Kla和H3K18la的表達(dá)均顯著上調(diào)（圖F）。
圖4
（3）接下來，對74例PDAC組織和72例癌旁組織（90對組織排除脫落切片、無胰管組織和形態(tài)明顯異常的癌旁組織）進(jìn)行免疫組化染色，評估H3K18la的臨床意義。如圖G和H所示，與正常組織相比，PDAC中H3K18la水平明顯上調(diào)。在PDAC患者中，51.4%的樣本顯示高H3K18la水平，比正常組普遍存在（圖I）。H3K18la水平的升高與AJCC的晚期呈正相關(guān)（圖J）。為了進(jìn)一步確定H3K18la的預(yù)后價值，采用基于H3K18la水平的Kaplan-Meier生存圖評估總生存率，通過Log-rank檢驗(yàn)確定H3K18la可能與預(yù)后相關(guān)（圖K）。
圖5
2、糖酵解抑制減少組蛋白乳酸化，抑制PDAC細(xì)胞增殖和遷移
（1）為了明確糖酵解對組蛋白乳酸化的影響，使用不同種類的糖酵解抑制劑（DCA、Oxamate和2-DG），分別在MIA的PaCa-2和AsPC-1細(xì)胞中進(jìn)行LDHA（催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸）的敲低。隨著抑制劑劑量的增加，Pan Kla和H3K18la的水平持續(xù)降低。此外，si-LDHA有效降低了組蛋白乳酸化水平，Nala（乳酸鹽）治療后組蛋白乳酸化水平顯著升高。
（2）隨后，研究了組蛋白乳酸化對細(xì)胞增殖的生物學(xué)功能。觀察到用DCA、Oxamate或2-DG處理后，細(xì)胞活力和集落形成能力顯著下降。此外，LDHA沉默對MIA PaCa-2和AsPC-1細(xì)胞的生長和集落形成均有明顯的抑制作用，而Nala則減弱了LDHA沉默對細(xì)胞增殖的抑制作用。
（3）這些發(fā)現(xiàn)表明組蛋白乳酸化在PDAC的起始和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用，而抑制組蛋白乳酸化可能對PDAC具有潛在的抗腫瘤活性。
3、H3K18la在PDAC中激活TTK和BUB1B轉(zhuǎn)錄
（1）接下來，試圖確定H3K18la如何影響PDAC進(jìn)展。使用抗H3K18la抗體進(jìn)行了CUT&Tag檢測。在處理組中，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）區(qū)域明顯減少（圖A和B），在啟動子區(qū)域觀察到約53%的富集（圖C）。對處理組中特異性啟動子區(qū)域下調(diào)峰的KEGG分析顯示，RNA轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、細(xì)胞周期和腫瘤相關(guān)途徑（如MAPK信號通路）中有相關(guān)的富集（圖D）。
（2）此外，通過RNA-seq檢測篩選乳酸化調(diào)控的潛在靶基因。與對照組相比，在PDAC細(xì)胞中，Oxamate處理上調(diào)了1259個基因，下調(diào)了303個基因（圖E）。對這些下調(diào)基因的KEGG分析也顯示，在Oxamate處理組中，細(xì)胞周期通路中富集（圖F）。CUT&Tag的基因本體（GO）分析和RNA-seq分析也顯示在細(xì)胞周期相關(guān)過程中富集。
（3）結(jié)合CUT&Tag、RNA-seq數(shù)據(jù)和GEPIA數(shù)據(jù)庫，該研究篩選出14個在PDAC中高表達(dá)且受H3K18la調(diào)控的基因，這些基因與細(xì)胞周期進(jìn)程緊密相關(guān)。利用ChIP-qPCR驗(yàn)證了H3K18la在TTK和BUB1B啟動子區(qū)的減少與糖酵解抑制劑使用相關(guān)，同時糖酵解抑制劑能下調(diào)這兩基因的mRNA和蛋白水平，揭示H3K18la通過糖酵解途徑調(diào)控它們的表達(dá)，影響PDAC進(jìn)程。
圖6
研究表明，CUT&Tag廣泛應(yīng)用于研究特定的染色質(zhì)修飾（如H3K27me3、H3K4me1等）在基因組上的分布。通過CUT&Tag，可以清晰地揭示不同染色質(zhì)修飾標(biāo)記在基因組上的定位，幫助理解基因調(diào)控的表觀遺傳機(jī)制。除此之外，CUT&Tag在其他研究領(lǐng)域也不可或缺。在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)鑒定方面，CUT&Tag能夠精確鑒定轉(zhuǎn)錄因子在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)，揭示其在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。在單細(xì)胞表觀組學(xué)中，由于CUT&Tag技術(shù)對樣本量的需求極低，單細(xì)胞CUT&Tag能夠揭示細(xì)胞群體中個體細(xì)胞的異質(zhì)性及染色質(zhì)狀態(tài)的差異。
CUT&Tag技術(shù)正在快速推動表觀遺傳學(xué)研究的前沿發(fā)展，百泰派克生物科技為您提供專業(yè)的CUT&Tag技術(shù)一站式服務(wù)，助您精準(zhǔn)解析染色質(zhì)狀態(tài)，揭示基因調(diào)控的奧秘，為疾病機(jī)制研究和藥物開發(fā)提供強(qiáng)有力的支持。我們的服務(wù)涵蓋從樣本準(zhǔn)備、抗體優(yōu)化到高通量測序及數(shù)據(jù)分析的全流程支持，確保為您提供高質(zhì)量的染色質(zhì)修飾和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析數(shù)據(jù)。與百泰派克合作，讓您的研究邁向新的高度！
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