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正式測定前務(wù)必取?2-3?個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義
測定原理
3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和?ATP?生成?1,3?二磷酸甘油酸。GAPDH?逆向催化?1,3?二磷酸甘油酸和?NADH?生成?3?磷酸甘油醛、無機(jī)磷和NAD，340nm?處測定?NADH?的減少量可反映GADPH?活性的高低。需自備的儀器和用品
分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96?孔板、研缽、冰和蒸餾水。試劑的組成和配制
提取液一：液體?100mL×1?瓶，4℃保存。提取液二：液體?100mL×1?瓶，4℃保存。試劑一：粉劑×1?瓶，-20℃保存；試劑二：液體?20mL×1?瓶，4℃保存；?試劑三：液體?14uL×1?支，4℃保存；?組織樣本的前處理
①總?GAPDH?酶提取：建議稱取約?0.1g?樣本，加入?1mL?提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰
浴，200W，破碎?3s，間歇?7s，總時(shí)間?1min），然后?4℃，8000g?離心?10min，取上清測定。
②胞漿和葉綠體?GAPDH?酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為?1：5～10的比例（建議稱取約?0.1g?樣本，加入?1mL?提取液一），冰浴勻漿后于?4℃，200g?離心?5min，棄沉淀，取上清在?4℃，8000g?離心?10min，取上清用于測定胞漿?GAPDH?酶活性，取沉淀加?1mL?提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎?3s，間歇?7s，總時(shí)間?1min），然后?4℃，8000g?離心?10min，取上清測定葉綠體中?GAPDH?酶活性。
建議測定總?GAPDH?酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的
GAPDH，則按照步驟②提取粗酶液。
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞的前處理
先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104?個(gè)）：提取液一體積（mL）為?500~1000：1?的比例（建議?500?萬細(xì)菌或細(xì)胞加入?1mL?提取液一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率?20％或?200W，超聲?3s，間隔?10s，重復(fù)?30?次）；8000g?4℃離心?10min，取上清，置冰上待測。
測定步驟
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱?30min?以上，調(diào)節(jié)波長至?340nm，蒸餾水調(diào)零。?2、 樣本測定
- 工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳動(dòng)物)或?25℃(?其它物種)預(yù)熱?10?分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
- 在試劑三中加入?500μL?蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
- 在微量石英比色皿或?96?孔板中加入?5μL?樣本、5μL?試劑三和?190μL?工作液，混勻，加入最后一個(gè)試劑的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，記錄?340nm?處20s?時(shí)的吸光值?A1?和?5min20s?后的吸光值?A2，計(jì)算?ΔA=A1-A2。
GAPDH?活性計(jì)算
- 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
- 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每?mg?組織蛋白每分鐘消耗?1 nmol?的?NADH?定義為一個(gè)酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V?反總÷（ε×d）×109]÷(V?樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr
- 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每?g?組織每分鐘消耗?1 nmol?的?NADH?定義為一個(gè)酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/g?鮮重）＝[ΔA×V?反總÷（ε×d）×109]÷(W?×V?樣÷V?樣總) ÷T=1286×ΔA÷W
- 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每一萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗?1?nmol?的?NADH?定義為一個(gè)酶活力單位。GAPDH（nmol/min/104?cell）＝[ΔA×V?反總÷（ε×d）×109]÷(500?×V?樣÷V?樣總) ÷T=2.572×ΔA V?反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4?L；ε：NADH?摩爾消光系數(shù)，6.22×103?L / mol /cm；d：?比色皿光徑，1cm；V?樣：加入樣本體積，0.005?mL；V?樣總：加入提取液體積，1?mL；T：?反應(yīng)時(shí)間，5?min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500?萬。
- 用?96?孔板測定的計(jì)算公式如下
- 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每?mg?組織蛋白每分鐘消耗?1 nmol?的?NADH?定義為一個(gè)酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V?反總÷（ε×d）×109]÷(V?樣×Cpr) ÷T=2572×ΔA÷Cpr
- 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每?g?組織每分鐘消耗?1 nmol?的?NADH?定義為一個(gè)酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/g?鮮重）＝[ΔA×V?反總÷（ε×d）×109]÷(W?×V?樣÷V?樣總) ÷T=2572×ΔA÷W
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