?使用中空纖維膜反應(yīng)器進(jìn)行蛋白質(zhì)連續(xù)高選擇性單PEG修飾
簡(jiǎn)介
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PEG修飾通過將聚乙二醇（PEG）偶聯(lián)到蛋白質(zhì)，從而增加蛋白藥物的治療效力，其作用主要體現(xiàn)在：1. 通過增加水力學(xué)尺寸，延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期；2. 降低給藥頻率，提高患者舒適性；3. 以無免疫原性PEG“遮蔽”抗原位點(diǎn)，降低藥物免疫原性；4. 親水性PEG成分穩(wěn)定PEG修飾蛋白，降低蛋白質(zhì)聚集。目前已有數(shù)種治療性PEG修飾蛋白藥物獲得FDA批準(zhǔn)。
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PEG修飾過程通常使用均相反應(yīng)器批處理進(jìn)行，常規(guī)的偶聯(lián)模式是將PEG偶聯(lián)到蛋白質(zhì)賴氨酸殘基的ε-氨基基團(tuán)上，但一個(gè)蛋白質(zhì)中一般有多個(gè)ε-氨基基團(tuán)，且由于反應(yīng)物、產(chǎn)物及副產(chǎn)物的共存，反應(yīng)液中會(huì)混合存在多種不同程度PEG修飾的蛋白質(zhì)，包括單、雙、三及多PEG修飾蛋白質(zhì)及其同分異構(gòu)體。從穩(wěn)定治療活性及產(chǎn)物精確鑒定方面來講，需要的產(chǎn)物為特定位點(diǎn)單個(gè)PEG分子修飾的蛋白質(zhì)，而由于不同PEG修飾蛋白的理化性質(zhì)十分相似，所以從混合液中純化單PEG修飾蛋白相當(dāng)困難。隨著對(duì)新型PEG修飾蛋白藥物質(zhì)量要求的嚴(yán)格化，蛋白質(zhì)PEG修飾過程的選擇性要求日益提高。
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對(duì)于提高PEG修飾過程選擇性的關(guān)注大多集中于位點(diǎn)特異性的新反應(yīng)技術(shù)，包括N-端PEG修飾、半胱氨酸PEG修飾、組氨酸親和標(biāo)簽及谷氨酸的PEG修飾等，但這些方法都無法避免多PEG修飾蛋白的形成。另一類方法是通過“物理”途徑來提高PEG修飾過程的選擇性，包括體積排阻反應(yīng)色譜及固相（“在柱”）PEG修飾，前者將反應(yīng)物以不同的脈沖注入色譜柱，各反應(yīng)物及產(chǎn)物因尺寸差異而被“隔開”，且以不同時(shí)間洗脫；后者將反應(yīng)物先后注入固定床，先注入反應(yīng)物固定在吸附物上，再與后注入反應(yīng)物反應(yīng)，然后以特定洗脫方式獲得高純度產(chǎn)物，兩種方法均可提高反應(yīng)的選擇性，但都局限于小規(guī)模的批量處理，不適于規(guī)模放大和工業(yè)化生產(chǎn)。
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本文旨在介紹一種提高蛋白質(zhì)單PEG修飾選擇性和程度的新技術(shù)，其原理可解釋如下：多數(shù)PEG試劑都是“單功能性”的，即一個(gè)PEG分子只能偶聯(lián)到一個(gè)蛋白質(zhì)分子，而一個(gè)蛋白質(zhì)分子具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，從而偶聯(lián)多個(gè)PEG。所以，當(dāng)反應(yīng)混合物中的PEG含量高于蛋白質(zhì)含量時(shí)，雖然蛋白質(zhì)的PEG修飾程度會(huì)提高，但多PEG修飾蛋白副產(chǎn)物的合成也會(huì)提高；而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)過量時(shí)，單PEG修飾的選擇性會(huì)提高（選擇性定義為轉(zhuǎn)化為單PEG修飾蛋白質(zhì)在所有形式PEG修飾蛋白質(zhì)中的比例），但蛋白質(zhì)修飾轉(zhuǎn)化率降低（轉(zhuǎn)化率定義為轉(zhuǎn)化為任一PEG修飾形式的蛋白質(zhì)的量），即造成蛋白質(zhì)浪費(fèi)。在傳統(tǒng)批量反應(yīng)中，如采用補(bǔ)料分批模式，該情況可有所緩解；但本實(shí)驗(yàn)決定測(cè)試一種新型的管狀反應(yīng)器，即蛋白質(zhì)在管狀通道內(nèi)流動(dòng)，而PEG軸向分散添加（圖1）。如果限制PEG的添加量，且保證蛋白質(zhì)過量，則可有效提高單PEG修飾蛋白合成的選擇性，并抑制多PEG修飾形式的合成，此外，蛋白質(zhì)和PEG的添加模式會(huì)在管道內(nèi)形成徑向物質(zhì)濃度梯度，進(jìn)一步提高選擇性。與傳統(tǒng)等量液相批量反應(yīng)模式相比，該模式的單PEG修飾選擇性和程度均可顯著提升。
圖1. 在管狀反應(yīng)器內(nèi)，通過在蛋白質(zhì)溶液軸線分散添加PEG試劑，以增加單PEG修飾選擇性的模式圖。
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基于以上理論，實(shí)驗(yàn)使用中空纖維膜反應(yīng)器（HMR），其原理如圖2所示。蛋白質(zhì)溶液從一端泵入纖維內(nèi)腔，PEG試劑注入殼腔（纖維外腔），沿纖維散狀分布。PEG修飾蛋白合成后，與未反應(yīng)蛋白和PEG一起，從出口流出。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ降鞍诪槿芫福?/span>MW 14,100； pI 11），PEG為甲氧基-PEG-（CH2）5COO-NHS（5kD PEG等量）。偶聯(lián)過程基于酰化作用形成酰胺鍵，即蛋白質(zhì)置換NHS基團(tuán)。
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2. 使用中空纖維膜反應(yīng)器進(jìn)行蛋白質(zhì)PEG修飾的模式圖。
2. 使用中空纖維膜反應(yīng)器進(jìn)行蛋白質(zhì)PEG修飾的模式圖。
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實(shí)驗(yàn)
HMR使用MicroKros中空纖維膜組件，產(chǎn)品編號(hào)X15S-300-04N，聚砜材質(zhì)，MWCO 50kD，纖維數(shù)量6根，纖維長(zhǎng)度20cm，纖維內(nèi)徑0.5mm，有效膜表面積20cm2。膜MWCO選擇50kD，可允許5kD的PEG自由通過。所有PEG修飾反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，反應(yīng)pH為8.0。
圖3. 中空纖維膜反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)設(shè)置：1）PEG試劑容器，2）泵，3）流量計(jì)，4）壓力傳感器，5）蛋白質(zhì)容器，6）泵，7）流量計(jì)，8）壓力傳感器，9）中空纖維組件，10）UV檢測(cè)器，11）樣品采集器。
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實(shí)驗(yàn)使用了批次液相PEG修飾反應(yīng)作為對(duì)照，并測(cè)試了不同PEG：溶菌酶摩爾比對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響。使用HMR系統(tǒng)進(jìn)行溶菌酶PEG修飾的過程采用連續(xù)模式進(jìn)行（圖3），同時(shí)打開兩個(gè)泵，將蛋白質(zhì)和PEG試劑以恒定流速分別泵入纖維內(nèi)腔和殼腔，起始反應(yīng)，產(chǎn)物從出口流出，經(jīng)UV檢測(cè)器后，收集樣品并經(jīng)SDS-PAGE分析。
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討論
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批量液相PEG修飾反應(yīng)通常使用過量的PEG試劑，以提高蛋白質(zhì)PEG修飾程度，但往往導(dǎo)致副產(chǎn)物合成增加；而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)過量時(shí)，雖然單PEG合成的選擇性提高了，修飾轉(zhuǎn)化率卻顯著降低。結(jié)果顯示，在批量液相模式中（PEG：蛋白質(zhì)摩爾比為4），單PEG修飾蛋白質(zhì)合成較快（15min以內(nèi)轉(zhuǎn)化率0.364，選擇性0.583），但隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，多PEG修飾蛋白質(zhì)逐漸形成，單PEG修飾蛋白轉(zhuǎn)化率和選擇性均下降。而如提高蛋白質(zhì)含量，單PEG修飾蛋白質(zhì)合成選擇性提高，但轉(zhuǎn)化率顯著下降；如提高PEG含量，則轉(zhuǎn)化率提高，選擇性下降，增加后期純化難度。
圖4. 批量液相反應(yīng)法制備產(chǎn)物SDS-PAGE圖，PEG：溶菌酶摩爾比為4，可見單PEG修飾的選擇性較低。
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實(shí)驗(yàn)測(cè)試了HMR模式的不同操作條件，如不同PEG：蛋白質(zhì)摩爾比、反應(yīng)（滯留）時(shí)間等。在均質(zhì)液相批量反應(yīng)器中，反應(yīng)器內(nèi)不同部位的反應(yīng)物及產(chǎn)物濃度不會(huì)有顯著差異，而在HMR中，由于設(shè)備構(gòu)造（管狀）和操作模式（分散添加）的原因，會(huì)形成反應(yīng)物/產(chǎn)物濃度梯度，所以反應(yīng)器內(nèi)溶菌酶的濃度應(yīng)表示為總表觀表觀濃度（Capp）：
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圖5. 中空纖維膜反應(yīng)器法制備產(chǎn)物SDS-PAGE圖，Rapp為0.65，τlm為13.7min，可見單PEG修飾選擇性較高。
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實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，PEG試劑沿中空纖維膜分散添加了單PEG修飾的程度和選擇性。溶菌酶、PEG試劑及PEG修飾溶菌酶在單根中空纖維內(nèi)的分布如圖6所示，中空纖維內(nèi)反應(yīng)物和產(chǎn)物的軸向和徑向濃度梯度均有利于提高單PEG修飾的程度和選擇性。由于PEG穿過膜進(jìn)入膜內(nèi)腔，其在纖維內(nèi)壁邊緣流動(dòng)區(qū)域的濃度最高；而溶菌酶在中軸線附近濃度最高，膜內(nèi)腔液流以“層流”模式流動(dòng)，故反應(yīng)物與產(chǎn)物的傳輸主要以擴(kuò)散方式進(jìn)行，溶菌酶徑向向外擴(kuò)散，PEG軸向向內(nèi)擴(kuò)散，兩者在某位點(diǎn)相遇并反應(yīng)，單PEG修飾蛋白質(zhì)合成后再從該區(qū)域向兩個(gè)方向擴(kuò)散。但如上所述，由于流動(dòng)模式為層流，反應(yīng)區(qū)與中軸線之間的液體流速高于反應(yīng)區(qū)與纖維壁之間的流速，所以單PEG修飾蛋白更多地傾向于“向內(nèi)”擴(kuò)散流動(dòng)，該過程將單PEG修飾蛋白帶離反應(yīng)區(qū)，從而提高反應(yīng)的選擇性，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)化率。
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圖6. HMR系統(tǒng)內(nèi)反應(yīng)物與產(chǎn)物的軸向及徑向濃度梯度分布。
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由討論可知，使用HMR進(jìn)行蛋白質(zhì)PEG修飾相比批次反應(yīng)釜處理，具有明顯優(yōu)勢(shì)，不僅單PEG修飾的選擇性和程度明顯提高，還可以連續(xù)模式進(jìn)行操作，且規(guī)模放大更簡(jiǎn)單，即更適于工業(yè)化生產(chǎn)。HMR系統(tǒng)也可用于其他需要控制選擇性的化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)。
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文獻(xiàn)來源：
Shang X., Ghosh, R., Membrane reactor for continuous and selective protein mono-PEGylation. Journal of Membrane Science, 2014, 451:177-184.
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