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染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）被用于檢測(cè)細(xì)胞核天然染色質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)的蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用。傳統(tǒng)的ChIP實(shí)驗(yàn)首先需要將細(xì)胞固定，這使得蛋白質(zhì)與DNA相互作用交聯(lián)固定到位。然后利用酶或者超聲的方法將染色質(zhì)打斷為片段，使用抗體對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)以及與其結(jié)合的DNA進(jìn)行免疫沉淀。最后解交聯(lián)，對(duì)沉淀DNA進(jìn)行純化。純化的DNA可進(jìn)行進(jìn)一步分析，如標(biāo)準(zhǔn)或定量PCR或測(cè)序。

這些實(shí)驗(yàn)對(duì)染色質(zhì)的完整性、抗原表位的穩(wěn)定性以及免疫沉淀抗體的特異性較為敏感。這些變量在所研究的蛋白質(zhì)與DNA相互作用具有較低的豐度和穩(wěn)定性時(shí)變得更為關(guān)鍵。

ChIP實(shí)驗(yàn)可以主要包括以下幾個(gè)步驟：

交聯(lián)固定→染色質(zhì)剪切→免疫沉淀→DNA純化→DNA檢測(cè)

（1）交聯(lián)固定

一般采用1% formaldehyde（甲醛）室溫交聯(lián)10-30分鐘，交聯(lián)的目的是為了建立蛋白質(zhì)/DNA之間的穩(wěn)定共價(jià)連接，這個(gè)過(guò)程要注意一下幾點(diǎn)。（1）一定要使用新鮮甲醛溶液，因?yàn)榧兹┤菀妆谎趸瑢?dǎo)致交聯(lián)不充分，在后續(xù)染色質(zhì)剪切的時(shí)候則容易破壞蛋白和DNA的共價(jià)連接。（2）交聯(lián)的時(shí)間10-30分鐘，如果研究對(duì)象為轉(zhuǎn)錄因子等豐度比較高，和DNA結(jié)合也很穩(wěn)定，交聯(lián)10min即可，如果研究對(duì)象為轉(zhuǎn)錄輔因子等豐度比較低，也不是直接與DNA結(jié)合，則適當(dāng)延長(zhǎng)交聯(lián)時(shí)間至30min。

（2）染色質(zhì)剪切

根據(jù)染色質(zhì)剪切方式的不同，目前市面上提供兩種試劑盒，酶解法和超聲法的試劑盒。

酶解法則是在交聯(lián)處理之后，加入適量的核酸酶特異性的切割核小體，將核小體切割成以1個(gè)、2個(gè)……核小體為單位的片段。到這里，有些小伙伴可能就摩拳擦掌準(zhǔn)備接下來(lái)的免疫沉淀了，但是小優(yōu)提醒您，酶解之后，樣品并沒(méi)有完全切割好，還需要經(jīng)過(guò)短暫的超聲處理，把細(xì)胞膜和核膜充分打碎，使染色質(zhì)片段完全釋放出來(lái)。

如果是超聲法，則比較簡(jiǎn)單了，調(diào)整到合適的超聲功率，將樣品超聲處理適當(dāng)?shù)臅r(shí)間就好了。在這個(gè)過(guò)程中要摸索好超聲的條件，過(guò)度超聲有可能破壞染色質(zhì)完整性，會(huì)給ChIP實(shí)驗(yàn)富集帶來(lái)負(fù)面影響，尤其是轉(zhuǎn)錄因子和輔因子。

到這里您可能會(huì)想，既然酶解和超聲法都有超聲處理，那為什么不直接選擇超聲法呢？這里要跟各位小伙伴強(qiáng)調(diào)一下了，酶解法后期的超聲時(shí)間相對(duì)較短，20-30S的超聲時(shí)間即可，所以相對(duì)而言比較好控制實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)于沒(méi)有做過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)的老師而言，也比較好操作了。超聲法因?yàn)閷?duì)超聲的功率和時(shí)間要求較高，適用于實(shí)驗(yàn)室條件比較成熟的老師。

（3）免疫沉淀

向樣品中加入抗體將目的蛋白和連接的DNA拉下來(lái)。這個(gè)過(guò)程中引入protein G微珠，將目的蛋白和與它結(jié)合的DNA拉下來(lái)，這個(gè)過(guò)程中或多或少也會(huì)把其他雜蛋白一起拉下來(lái)，所以接下來(lái)進(jìn)行高鹽和低鹽的洗脫，去掉雜質(zhì)。

在這個(gè)過(guò)程中選擇合適的抗體對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。如果您需要做測(cè)序，則要選擇ChIP-seq級(jí)的抗體，如果只是做PCR，選擇ChIP級(jí)抗體即可。因?yàn)?/font>ChIP級(jí)抗體除了要結(jié)合完全裸露的靶蛋白之外，還要結(jié)合因構(gòu)象變化被DNA遮蔽的抗原表位，而ChIP-seq則需要檢測(cè)全基因組上大量的成千上萬(wàn)的基因位點(diǎn)。所以要嚴(yán)格選擇相應(yīng)級(jí)別的抗體。