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? ? ? ? ? ? 2017年7月5日，Nature發(fā)布單細胞生物學特刊，將視線聚焦于生命的最基本單位：細胞。特刊表示，當前生命科學領域已經(jīng)逐漸步入單細胞生物學時代，單細胞測序技術的進步使我們能夠在單細胞層面繪制復雜機體的細胞圖譜，探索機體細胞的類型、它們的作用及發(fā)展過程。 ?
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圖1. 人類細胞圖譜計劃
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? ? ? ?2016年，人類細胞圖譜計劃（HumanCell Atlas Project）被提出：根據(jù)獨特的分子信息（如基因表達）對所有人類細胞種類進行定義，并將這些信息與傳統(tǒng)的細胞學表述（如位置和形態(tài)）相關聯(lián)，來了解人體中的所有細胞的類型、每個細胞的空間位置、每個細胞在不同生命時刻的狀態(tài)以及不同個體細胞圖譜的疊加，并根據(jù)不同健康狀態(tài)、基因型、生活方式和外界環(huán)境加以注釋。
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圖2. 單細胞測序技術應用的技術路線
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? ? ? ?而傳統(tǒng)的單細胞測序技術只是對單個細胞進行轉(zhuǎn)錄組學的研究，很難實現(xiàn)大通量單細胞轉(zhuǎn)錄組測序；近年來，單細胞測序技術獲得快速發(fā)展，尤其是基于微液滴技術的大規(guī)模單細胞分選平臺的出現(xiàn)，使我們能夠以較低的成本對某一器官或者組織構建其細胞表達圖譜，了解各個器官或者組織細胞復雜的基因網(wǎng)絡在單個細胞中的運作機制，并了解各個細胞中這些網(wǎng)絡的差異，以及最終各種細胞群體如何協(xié)同工作。
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圖3. 大規(guī)模單細胞測序技術構建人類細胞圖譜
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? ? ? ?2016年2月，10X Genomics公司推出大規(guī)模單細胞轉(zhuǎn)錄組測序系統(tǒng)——Chromium? Single Cell 3' Solution，可以對高通量的數(shù)字基因表達的復雜細胞群進行深入分析，引領生命科學研究進入單細胞生物學時代。
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? ? ? ?作為國內(nèi)第一家引進10X Genomics平臺的公司，博奧晶典率先推出了Chromium? SingleCell 3' Solution平臺服務，并完成了人和小鼠的肝臟、肺臟、皮膚、心臟、腦、腎臟、血液，以及植物葉片等多種類型樣本的檢測。
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? ? ? ?Chromium? Single Cell 3' Solution是一種在單個細胞水平對mRNA進行高通量測序的新技術，為單細胞轉(zhuǎn)錄組研究提供更具擴展性的平臺。其基于10X Genomics平臺，一次性能夠分離500~10000個單細胞，并能夠?qū)⒎蛛x的單個細胞中的微量mRNA通過高效擴增后再進行高通量測序，有效地解決了組織樣本無法破解的細胞異質(zhì)性難題，有助于發(fā)現(xiàn)新的細胞類型；并基于大量的單細胞基因表達數(shù)據(jù)，可進行細胞表達特征聚類、亞群表達特征、標志物篩選等方面的分析，是一種高效的細胞基因表達水平的檢測技術，在生殖、免疫反應、干細胞發(fā)育與分化、腫瘤異質(zhì)性、神經(jīng)系統(tǒng)研究以及腦發(fā)育等研究領域中有著廣泛的應用。
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圖4. Chromium?Single Cell 3' Solution平臺
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1基本技術原理
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? ? ? ?Chromium? Single Cell 3'Solution是建立在 GemCode技術上的微流體平臺，將帶有條形碼和引物的凝膠珠與單個細胞包裹在油滴中；接下來在每個油滴內(nèi)，凝膠珠溶解，細胞裂解釋放mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生用于測序的帶條形碼的cDNA；液體油層破壞后，cDNA后續(xù)進行文庫構建，然后使用Illumina測序平臺對文庫進行測序檢測，即可一次性獲得大量單細胞的基因表達數(shù)據(jù)，從而實現(xiàn)在單細胞水平進行表達測序的目的。 圖5. Chromium? SingleCell 3' Solution技術原理 2實驗流程 ? 將樣本制成單細胞懸浮液，用Countess? II Automated Cell Counter或者Countstar 進行細胞計數(shù)和細胞活性測定，然后將細胞濃度調(diào)整到理想濃度1000個/μL；利用10X Genomics平臺標記cDNA，從而完成單細胞轉(zhuǎn)錄組文庫的構建；進一步用Illumina HiSeq平臺或者NextSeq平臺進行測序，獲得每個細胞的基因表達數(shù)據(jù)；基于單細胞基因表達數(shù)據(jù)進行細胞表達特征聚類、亞群表達特征、標志物篩選等方面的分析。 ? 圖6. Chromium? SingleCell 3' Solution實驗流程 ? 3樣本要求 ? 樣品類型：新鮮細胞懸液、血液（全血、PBMC等）、培養(yǎng)細胞瓶（皿）、植物原生質(zhì)體、 凍存細胞懸液。 質(zhì)量要求：細胞活性大于90%，濃度為500~2000cell/μl，體積大于200微升，不含有Ca2?和Mg2?。 保存運輸：新鮮樣品冰塊保存、新鮮運輸；凍存樣品干冰運輸。 ? ? ? ? 1. 細胞選取靈活：每個樣本細胞數(shù)可達500-80, 000個，細胞數(shù)量可以靈活選??； 2. 項目周期短：10min內(nèi)實現(xiàn)對上萬個細胞的封裝，1天內(nèi)即可完成細胞懸液制備、單細胞捕獲、擴增及建庫，且可同時獲得上萬個細胞的分析結果，大大縮短項目周期； 3. 細胞捕獲效率高：單個細胞捕獲率高達65%，高效獲取每個細胞中的基因表達； 4. 真正大規(guī)模單細胞測序：單個液滴捕獲到多個細胞的概率極低，0.9%/1000cells，分析上通過嚴格質(zhì)控，利用barcode信息及UMI去除含多個細胞數(shù)據(jù)，實現(xiàn)真正意義上的單細胞測序； 5. 低成本：相較于其他單細胞平臺，如Fluidigm C1平臺、已推的Illumina Bio-RadSingle Cell Solution平臺或傳統(tǒng)手工擴增方法等，價格大幅優(yōu)惠； 6. 應用范圍廣：對細胞類型無限制，已成功應用于識別細胞周期、腫瘤細胞異質(zhì)性研究、鑒定罕見細胞類型、免疫細胞分型、疾病分型等領域； 7. 高性價比：與傳統(tǒng)手工細胞分離測序方法相比，價格優(yōu)惠數(shù)十倍； 8. 豐富的項目經(jīng)驗：目前完成了人和小鼠的肝臟、肺臟、皮膚、心臟、腦、腎臟以及植物葉片等樣本類型的檢測。 ? ? ? ? 相比于其他大規(guī)模單細胞分選平臺，Chromium? Single Cell 3' Solution在通量、成本以及周期等方面具有明顯的平臺優(yōu)勢。 ? 表1. 大規(guī)模單細胞分選平臺之間的比較 ? ? ? ? Chromium? Single Cell 3'Solution平臺已經(jīng)發(fā)表8篇高水平文章（Nature、Cell、Nature Methods等），總影響因子達到167.467，已經(jīng)廣泛應用于方法學研究、細胞發(fā)育、免疫反應、干細胞分化等研究領域。 ? 表2. Chromium? SingleCell 3' Solution平臺已經(jīng)發(fā)表的相關文章 ? ? ? ? 1應用領域一：人類細胞圖譜構建 ? 人體由數(shù)萬億細胞構成，細胞是生命的基本單位，是理解健康和疾病生物學的關鍵，但目前我們對細胞在每個器官之間的差異的理解非常有限，甚至不知道在體內(nèi)有多少不同類型的細胞。人類細胞圖譜構建是理解細胞新時代的開始，將有助于發(fā)現(xiàn)新的細胞類型，發(fā)現(xiàn)細胞在發(fā)育和疾病期間如何隨時間變化，從而獲得對生物學的更好理解。 ? 利用Chromium? Single Cell 3' Solution平臺，研究人員可以對人體各種細胞進行測序，獲得人體單細胞的轉(zhuǎn)錄組圖譜，并基于基因表達將細胞分類，定義新的細胞，繪制所有細胞及其分子的空間組織方式，探索人體各個器官細胞復雜的基因網(wǎng)絡在單個細胞中的運作機制，并了解各個細胞中這些網(wǎng)絡的差異，以及各種細胞群體最終如何協(xié)同工作。 ? 2應用領域二：腫瘤異質(zhì)性研究 ? 腫瘤的異質(zhì)性是惡性腫瘤的特征之一，在腫瘤的生長過程中，經(jīng)過多次分裂增殖，其子細胞呈現(xiàn)出分子生物學或基因方面的改變，從而使腫瘤的生長速度、侵襲能力、對藥物的敏感性、預后等各方面產(chǎn)生差異。 ? 利用Chromium? Single Cell 3' Solution平臺，可為腫瘤研究人員提供大量基因表達信息，來進行腫瘤細胞異質(zhì)性研究、腫瘤細胞分群以及新類型細胞的發(fā)現(xiàn)，進一步研究腫瘤細胞克隆進化機制及相關新生物標記的鑒定等，將會有助于腫瘤的精準治療。 ? 3應用領域三：干細胞發(fā)育以及分化 ? 地 址： 北京市亦莊經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)科創(chuàng)六街88號，亦莊生物醫(yī)藥園C座 聯(lián)系人： 市場部 電 話： 18600397163 傳 真： Email：zhiyuanjing@capitalbiotech.com
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