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免疫療法的誕生和發(fā)展是本世紀(jì)癌癥治療領(lǐng)域里程碑式的進(jìn)步[1]，對(duì)于眾多因傳統(tǒng)治療不耐受或無緩解而深陷絕望的患者來說，免疫療法很有可能為他們提供一根新的救命稻草。免疫檢查點(diǎn)抑制劑在免疫療法中最富前景，已有數(shù)款免疫檢查點(diǎn)抑制劑獲批上市[2]。然而，由于免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的存在以及腫瘤細(xì)胞與免疫系統(tǒng)間的相互作用，免疫檢查點(diǎn)抑制劑的響應(yīng)率仍然很低，只有20-30%的患者能從中獲益[3]。腫瘤微環(huán)境由多種細(xì)胞組成，包括腫瘤細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (Treg)、成纖維細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 (TAM)等。TAM在瘤內(nèi)含量豐富，占腫瘤質(zhì)量的近50% [4]，而且TAM的存在通常與腫瘤預(yù)后不良有關(guān)[6]。因此，重編程TAM細(xì)胞，以恢復(fù)其腫瘤殺傷功能引起了人們極大的興趣，正發(fā)展為一種改善腫瘤免疫治療效果的富有前景的新興療法[5]。

但重編程后，TAM易受腫瘤微環(huán)境中抑制性因子如IL-4、IL-13、IL-10和M-CSF等的影響，傾向于轉(zhuǎn)化回促腫瘤生長(zhǎng)的TAM[6]。因此，免疫檢查點(diǎn)阻斷與腫瘤微環(huán)境重塑相結(jié)合，是腫瘤免疫治療領(lǐng)域有巨大前景的重要發(fā)展方向。2021年12月24日，北大藥學(xué)院齊憲榮教授團(tuán)隊(duì)在Nano Today發(fā)表題為CRISPR-based in situ engineering tumor cells to reprogram macrophages for effective cancer immunotherapy的研究文章，并報(bào)道了一種名為HPT-PFs的選擇性響應(yīng)基因加速遞送系統(tǒng)，成功將黑色素瘤細(xì)胞原位編輯為CD47敲除且生產(chǎn)IL-12的工程細(xì)胞，使移植瘤在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)受到了顯著抑制。該項(xiàng)研究表明，CRISPR介導(dǎo)的CD47阻斷與腫瘤細(xì)胞中IL-12生產(chǎn)的結(jié)合可以協(xié)同促進(jìn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫治療，為基于CRISPR的腫瘤細(xì)胞原位基因編輯應(yīng)用于腫瘤免疫治療奠定了基礎(chǔ)。

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研究團(tuán)隊(duì)利用腫瘤中高表達(dá)CD44受體和基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMPs) 的特性，設(shè)計(jì)出了選擇性響應(yīng)加速基因遞送系統(tǒng) (HPT-PFs)，將CD47阻斷與IL-12產(chǎn)生結(jié)合，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原位改造用于巨噬細(xì)胞介導(dǎo)免疫治療。該系統(tǒng)首先用氟化的聚乙烯亞胺模塊 (PF) 與質(zhì)粒形成復(fù)合物內(nèi)核以提高細(xì)胞攝取、DNA內(nèi)體逃逸和解離的幾率，從而實(shí)現(xiàn)遞送效率的大幅提高[7-9]。然后，作者引入透明質(zhì)酸 (HA) 和腫瘤微環(huán)境敏感肽 (TMSP)，作為腫瘤選擇性響應(yīng)模塊 (HA-PEG-TMSP，簡(jiǎn)稱HPT)，進(jìn)一步包覆在內(nèi)核上以提高腫瘤靶向性和被細(xì)胞內(nèi)化的幾率（圖1）。TMSP由細(xì)胞穿透肽 (CPP) 和MMPs可切割肽接頭 (PVGLIG) 連接的屏蔽肽組成，屏蔽肽在腫瘤部位被過表達(dá)的MMP 選擇性切除，并因此暴露CPP以促進(jìn)細(xì)胞攝取而實(shí)現(xiàn)基因靶向遞送。

圖1. HPT-PFs 納米粒子組裝設(shè)計(jì)示意圖

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隨后，作者通過一系列細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，評(píng)估了HPT-PFs系統(tǒng)在體外遞送基因的性能。與傳統(tǒng)遞送載體相比，HPT-PFs遞送后CD47敲除率顯著升高。同時(shí)，成功編輯的B16F10小鼠黑素瘤細(xì)胞能轉(zhuǎn)化為IL-12生產(chǎn)工廠，并增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)自身的吞噬。接著，團(tuán)隊(duì)通過皮下注射 B16F10細(xì)胞的方式構(gòu)建了荷瘤小鼠模型，在體內(nèi)證明HPT-PFs能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)（圖2. a-c），并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡（圖2. d,e）。

圖2.HPT-PFs 納米粒的體內(nèi)抗腫瘤療效

為進(jìn)一步確認(rèn)HPT-PFs的體內(nèi)遞送效率和抗腫瘤機(jī)制，作者使用Bioss抗體，通過IHC檢測(cè)了腫瘤組織切片中CD47的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：在HPT-PFs (CD47) 組和HPT-PFs (CD47-IL12) 組中觀察到CD47表達(dá)降低（圖3. a），證明了HPT-PFs在體內(nèi)也能有效地介導(dǎo)基因遞送，敲除CD47，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的原位編輯。IL-12是促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化的重要細(xì)胞因子[10]。為進(jìn)一步探究原位編輯工程腫瘤細(xì)胞對(duì)TAM極化傾向的影響，研究團(tuán)隊(duì)使用Bioss抗體對(duì)腫瘤組織進(jìn)行IF檢測(cè)（圖3. b）。結(jié)果顯示：在HPT-PFs (CD47-IL12) 組中M1型的巨噬細(xì)胞 (CD86+) 顯著增加，而M2型的巨噬細(xì)胞 (CD206+) 顯著減少，并產(chǎn)生了更多的TNF-α（圖3. b）。以上結(jié)果說明腫瘤組織中的TAM發(fā)生了重編程，并轉(zhuǎn)化為了具有促炎和免疫監(jiān)視功能的M1型的巨噬細(xì)胞。先前的研究表明，抑制血管形成是IL-12的關(guān)鍵抗腫瘤機(jī)制。該過程依賴于IFN-γ的分泌[11]。因此，作者繼續(xù)檢測(cè)了腫瘤組織切片中的IFN-γ和血管生成情況。在HPT-PFs (CD47-IL12) 組中發(fā)現(xiàn)IFN-γ水平顯著升高，且CD31陽(yáng)性信號(hào)減少，標(biāo)志著腫瘤血管生成受到了顯著的抑制（圖3. b）。總的來說，這些結(jié)果表明腫瘤CD47阻斷與IL-12生產(chǎn)的組合療法可以重編程TAM從而實(shí)現(xiàn)有效的抗腫瘤效應(yīng)。

圖3. HPT-PFs 原位編輯的腫瘤細(xì)胞使TAM 重編程并發(fā)揮抗腫瘤功效

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相關(guān)產(chǎn)品信息

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一抗類

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其他類

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參考文獻(xiàn)

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