?高內(nèi)涵成像技術(shù)在單抗結(jié)合檢測(cè)中的應(yīng)用
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優(yōu)點(diǎn)
?? ? ? ? ? ? ? ??無需沖洗的檢測(cè)方法提高效率，減小浪費(fèi)
???????????? 應(yīng)用范圍廣，可用于貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞及免疫磁珠
???????????? 可用任何波長(zhǎng)的熒光標(biāo)記
???????????? 高敏感度可檢測(cè)低豐度抗原
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單抗結(jié)合檢測(cè)方法的發(fā)展大大提高了細(xì)胞及免疫磁珠的高通量，高內(nèi)涵分析效率。這種不用沖洗，基于熒光微孔分析技術(shù)（fluorometric microvolume assay technology, FMAT）的方法可以快速的針對(duì)更少量的細(xì)胞進(jìn)行篩選，而且在傳統(tǒng)樣本檢測(cè)中由于多次洗板造成的細(xì)胞損失也完全可以避免。
?抗體的發(fā)現(xiàn)在診斷疾病，研發(fā)疫苗和治療疾病的過程中起到重要作用。研究者們利用雜交瘤細(xì)胞或者形成克隆來篩選高表達(dá)克隆株，檢測(cè)細(xì)胞表面的抗體結(jié)合效率，觀測(cè)抗體或配體在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)化。在傳統(tǒng)的FMAT檢測(cè)方法的已有優(yōu)點(diǎn)之上，利用ImageXpress? Micro 寬場(chǎng)高內(nèi)涵分析系統(tǒng)進(jìn)行操作的單抗結(jié)合檢測(cè)方法可以讓科學(xué)家們?cè)谕粋€(gè)平板孔中檢測(cè)多種不同細(xì)胞的表面抗體結(jié)合情況。這一系統(tǒng)也可以將檢測(cè)規(guī)模提升到1536孔板，并且只需要2-3微升的樣本。即使用更低的二抗?jié)舛龋錂z測(cè)范圍和靈敏度也不會(huì)下降，甚至有所提高。
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檢測(cè)原理
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抗體被富集在磁珠上并用帶熒光的二抗進(jìn)行標(biāo)記。熒光成像技術(shù)可以檢測(cè)被磁珠捕獲的抗體數(shù)量。利用類似的方法同樣可以檢測(cè)細(xì)胞表面結(jié)合的配體以及配體和抗體的內(nèi)化。
?在單抗結(jié)合檢測(cè)過程中（圖1），應(yīng)將貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞或抗體包被磁珠樣本加入到96,384,1536孔板中。然后加入一抗（目標(biāo)抗體），接著用二抗對(duì)一抗進(jìn)行標(biāo)記來檢測(cè)一抗的結(jié)合情況。
所有的檢測(cè)試劑加到微孔板后都無需沖洗。細(xì)胞或抗體包被的免疫磁珠被固定在孔板底部表面，即使孔板底部有高背景熒光，陽性信號(hào)也可被識(shí)別并分析。
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線性和檢測(cè)范圍
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在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們將不同濃度的一抗滴定使之與7微米的磁珠結(jié)合。加入被分析物，用二抗標(biāo)記并利用ImageXpress ?Micro高內(nèi)涵分析系統(tǒng)成像。傳統(tǒng)的FMAT檢測(cè)方法只能利用紅色（Cy5）通道進(jìn)行檢測(cè)，而IImageXpress ?Micro?系統(tǒng)可以捕捉到多種波長(zhǎng)圖像，所以任何二抗標(biāo)簽都可以用來標(biāo)記及檢測(cè)。在這個(gè)滴定實(shí)驗(yàn)中，二抗是用DyLight 488標(biāo)記的。
?MetaXpress? 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件中應(yīng)用Count Nuclei 模塊對(duì)圖像進(jìn)行分析，所得出的最低檢測(cè)閾值（LLD）為0.5ng/ml（30pg/well），線性響應(yīng)大概在1-31ng/ml。此次一抗滴定實(shí)驗(yàn)的曲線顯示出了“前帶現(xiàn)象（prozone）”，以及與單抗結(jié)合檢測(cè)相關(guān)的“鉤狀現(xiàn)象（hook effect）”。在曲線頂峰的信號(hào)衰減是由于未結(jié)合的一抗在介質(zhì)中與二抗結(jié)合，使之未能與細(xì)胞和磁珠結(jié)合所致（圖2）。
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免疫磁珠的一抗結(jié)合曲線見上圖。12.7微米包被羊抗小鼠抗體的磁珠被結(jié)合到不同濃度的小鼠lgG抗體上，并加到微孔板中，在孔板中與標(biāo)記AlexaFluor488的二抗室溫下共孵育1-2個(gè)小時(shí)，實(shí)驗(yàn)設(shè)四個(gè)復(fù)孔及同型抗體對(duì)照孔。圖像為10X PlanFluor物鏡拍攝。孔板的縮略圖（下）清晰的顯示出抗體結(jié)合的濃度梯度。分析結(jié)果：LLD 為0.5 ng/mL (30 pg/well)，在1-31ng/mL之間呈線性關(guān)系。
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多波長(zhǎng)分析更準(zhǔn)確的測(cè)定細(xì)胞響應(yīng)
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除了熒光圖像外，ImageXpress Micro系統(tǒng)還可以捕捉到透射光圖像（transmitted light, TL）從而更準(zhǔn)確的鑒別細(xì)胞。在這個(gè)基于細(xì)胞的檢測(cè)例子中，系統(tǒng)同時(shí)捕捉了透射光和熒光圖像，并用MetaXpress 軟件的用戶自定義模塊對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。
對(duì)同一個(gè)孔的熒光圖像觀察顯示抗體已經(jīng)結(jié)合到了細(xì)胞表面，但是如果將熒光和透射光圖像疊加就可以看到并非每個(gè)細(xì)胞都和抗體結(jié)合在一起（圖3，左上）。隨后的圖像分析正確的篩選出了與抗體結(jié)合的陽性細(xì)胞（圖3，右上）。另一個(gè)孔的Cy5通道圖像顯示出高熒光信號(hào)，意味著抗體的有效結(jié)合。然而，通過透射光和熒光的疊加分析可以看出此孔中的細(xì)胞并未與熒光有效結(jié)合（圖3，左下）。圖像分析確定了這些高熒光信號(hào)是由人為因素而非細(xì)胞本身引起的，所以這些細(xì)胞被標(biāo)記為未連接到抗體（圖3，右下）。
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上：Cy5（紅色）和透射光（半透明）圖像疊加后顯示出所有抗體結(jié)合的陽性和陰性細(xì)胞（左）。分析圖中將抗體結(jié)合的陰性細(xì)胞顯示為黃色，陽性細(xì)胞（Cy5通道）顯示為藍(lán)色，重疊的部分為白色（右）。
下：Cy5（紅色）和透射光（半透明）圖像疊加后顯示出沒有與細(xì)胞重疊的雜質(zhì)熒光（左）。分析圖中將抗體結(jié)合的陰性細(xì)胞顯示為黃色， Cy5通道陽性但與細(xì)胞無關(guān)的雜質(zhì)顯示為粉色（右）。
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? ? ? ? ??檢測(cè)實(shí)驗(yàn)可以很容易的通過優(yōu)化二抗?jié)舛葋泶_定條件。在這個(gè)例子中，我們用三種不同濃度的二抗來結(jié)合寬濃度范圍的一抗。就如之前的磁珠檢測(cè)結(jié)果一樣，實(shí)驗(yàn)顯示出了很好的“鉤狀現(xiàn)象（hook effect）”（圖4，上）。當(dāng)二抗?jié)舛葹?/span>0.25μg/mL時(shí)的最低檢測(cè)閾值為0.5ng/ml，這一數(shù)值與標(biāo)準(zhǔn)的FMAT方法一樣。三種濃度的二抗在滴定范圍內(nèi)都顯示出了良好的線性（圖4，下）。
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上：三種不同濃度二抗的一抗滴定實(shí)驗(yàn)（顯示于X軸）。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 下：結(jié)果表明，分析物（一抗）在五倍稀釋梯度下呈線性關(guān)系，其LLD為0.5ng/mL
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基于圖像的單抗檢測(cè)分析更具靈活性
? ? ? 與傳統(tǒng)的FMAT檢測(cè)方法相比，應(yīng)用ImageXpress Micro系統(tǒng)和 MetaXpress軟件的單抗結(jié)合高內(nèi)涵成像分析方法可以提供更多的信息。本系統(tǒng)可以在消除通常人為誤差的基礎(chǔ)上更快速的得到準(zhǔn)確的細(xì)胞響應(yīng)，從而得到更精確的結(jié)果。另外，科學(xué)家們可以檢測(cè)配體與細(xì)胞表面的結(jié)合并進(jìn)一步在任意波長(zhǎng)檢測(cè)二抗標(biāo)簽，在一個(gè)平板上檢測(cè)不同細(xì)胞以及在不影響靈敏度的情況下將檢測(cè)擴(kuò)展到1536孔板。
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