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??二代測序是一個強(qiáng)大的功能平臺，它可以同時給數(shù)以萬計的DNA分子進(jìn)行測序。由于這種可以多個樣本同時測序的能力，在個性化醫(yī)療、遺傳疾病和臨床診斷等方面，二代測序也就是高通量測序開創(chuàng)了革命性的領(lǐng)域。
早在1900年代就發(fā)明的Sanger測序法，成為了DNA測序的黃金法則，即便到了今天它仍被廣泛用來進(jìn)行常規(guī)測序和NGS數(shù)據(jù)的驗證。它利用高保真DNA聚合酶生成與單鏈DNA模版互補(bǔ)的拷貝。在每個反應(yīng)中，一個可以特異性識別模版的單鏈引物，可以從3端開始啟動DNA合成，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，脫氧核糖核苷酸或簡單的核苷酸是一個接一個的與模版配對。
每個反應(yīng)還包含四種雙脫氧核糖核苷酸的混合物，每一種對應(yīng)一個DNA堿基。這些雙脫氧核糖核苷酸與DNA單體十分類似，因此可以參與DNA鏈的增長，但是他們和天然的脫氧核糖核苷酸有兩點(diǎn)不同：
(1)他們?nèi)鄙僖粋€會影響DNA鏈進(jìn)一步衍生的3’羥基。在DNA延伸過程中，這個3’羥基一旦加入DNA分子中就會導(dǎo)致鏈的終止;
(2)每個雙脫氧核糖核苷酸都有獨(dú)特的熒光染料吸附，使得DNA測序的自動檢測得以進(jìn)行。
于是，每個反應(yīng)會產(chǎn)生許多不同長度的DN**段，并在模版的任一核苷酸位置上由其中一種雙脫氧核糖核苷酸終止鏈的延伸。反應(yīng)混合物可以通過手動灌膠或自動灌膠到用毛細(xì)管進(jìn)入測序機(jī)器，再根據(jù)DNA分子大小不同用電泳分離DNA。當(dāng)DNA流過凝膠后，DNA序列可以通過雙脫氧核糖核苷酸上發(fā)出的熒光來進(jìn)行分析。當(dāng)今的Sanger測序儀使用的是毛細(xì)管自動上樣的凝膠電泳，一般可以同時分析8-96個系列反應(yīng)。
二代測序系統(tǒng)在十年前就是因其可同時進(jìn)行大量平行測序反應(yīng)而廣為人知。這些系統(tǒng)可以同時分析百萬甚至上億個序列反應(yīng)。雖然不同的機(jī)器生產(chǎn)時會在技術(shù)細(xì)節(jié)上有許多不同，但他們都有以下幾個共同點(diǎn)：
1,文庫建立：所有二代測序的平臺都需要一個基因文庫，這個基因文庫包含通過引申或者連接自定義的接頭序列。
2,測序儀器：每個文庫片段在共階吸附的DNA連接因子的作用下，以文庫適配序列為模版，在固體表面上進(jìn)行擴(kuò)增。這步擴(kuò)增會產(chǎn)生許多DNA蔟，每個來源于一個文庫片段，每個基因蔟都會像獨(dú)立的測序反應(yīng)一樣起作用。
3,數(shù)據(jù)輸出：每個儀器都會在測序結(jié)束后給出原始數(shù)據(jù)。這個原始數(shù)據(jù)時每個基因蔟中形成的DNA序列的集合。
不同的二代測序平臺的區(qū)別主要體現(xiàn)在測序反應(yīng)的技術(shù)上，這些差別可以分為4類：
焦磷酸測序，合成法測序，連接法測序和離子半導(dǎo)體測序。
焦磷酸測序
在焦磷酸測序中，測序反應(yīng)通過每個核苷酸結(jié)合過程中釋放的焦磷酸來調(diào)控。釋放的焦磷酸參與了一系列化學(xué)反應(yīng)從而導(dǎo)致鏈光的產(chǎn)生。發(fā)出的光由記錄基因蔟相應(yīng)序列的相機(jī)來檢測。測序反應(yīng)開始后，先一次孵育一個堿基，測量光發(fā)射情況(如果有的話)，在降解未參與反應(yīng)的堿基，最后加入另一個堿基。這項技術(shù)能夠產(chǎn)生較大的讀取長度，已經(jīng)可以與Sanger測序法得到的讀取長度相比較。然而，高昂的試劑花費(fèi)，和有6個或以上的均聚物會產(chǎn)生的高錯誤率阻礙了這個技術(shù)的應(yīng)用。
合成法測序
合成測序法是使用可逆熒光和終止核苷酸的分步整合的方法進(jìn)行DNA測序，并已被ll lumina NGS平臺使用。首先在測序芯片中同時加入四種核苷酸，核苷酸結(jié)合之后，剩余的DNA堿基就會被洗滌去除。每個基因蔟中熒光信號被讀取和記錄之后，這個過程一直重復(fù)直到測序反應(yīng)完成。這個系統(tǒng)能通過一次只結(jié)合一個核苷酸來克服焦磷酸測序的缺點(diǎn)。然而，當(dāng)測序反應(yīng)進(jìn)行時，儀器的錯誤率也在增加。這是因為去除不完全的熒光信號會導(dǎo)致更高的背景噪聲。
連接測序法
連接測序法與其他兩種方法不同，因為他不用DNA聚合酶來結(jié)合核苷酸，而是用16種8-mer Oligo核苷酸探針，在相互連接的5端，每個探針都吸附了四種熒光染料其中的一種。每8-mer包含兩個探針特異堿基，和6個退化堿基。測序反應(yīng)開始時，引物先結(jié)合到適配序列上，再和相應(yīng)探針結(jié)合。這個探針的結(jié)合時在退火條件下由兩個探針特異堿基引導(dǎo)，再由DNA連接酶連接到引物序列上。未結(jié)合的oligo核苷酸被洗去后，熒光信號就開始檢測會記錄。在這之后，切割掉熒光信號和8-mer探針的最后3個堿基，就可以開始下一個循環(huán)了。在大約7個循環(huán)的連接之后，DNA會變性，而另一個測序引物，在前一個引物的下一個堿基后開始重復(fù)這些步驟，總共用5個測序引物。這項技術(shù)的主要缺點(diǎn)就是產(chǎn)生的測序片段特別短。
離子半導(dǎo)體測序
離子半導(dǎo)體測序法時在測序反應(yīng)種通過釋放氫離子來檢測一個基因蔟的序列。每個基因蔟直接定位在一個半導(dǎo)體三極管上，這個半導(dǎo)體三極管可以檢測溶液的ph值。在核苷酸結(jié)合過程中，一個氫離子被釋放到溶液中并會被半導(dǎo)體三極管檢測到。這個測序反應(yīng)的進(jìn)行過程和焦磷酸法類似，但是花費(fèi)只是他的幾分之一。