?免疫組化的介紹
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免疫組化---概念
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免疫組織化學(xué)
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? 免疫組化是利用抗原與抗體特異性
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結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體
的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子
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、同位素) 顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗
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原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進(jìn)行定位、
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定性及定量的研究，稱為免疫組織化
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學(xué)。
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免疫組化---分類
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根據(jù)標(biāo)記物不同分為：
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免疫熒光法
??????利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。
免疫酶標(biāo)法
??????基本原理是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。
免疫膠體金法
???????用膠體金標(biāo)記抗體作為探針，就能對組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。
免疫鐵蛋白法
???????以鐵蛋白標(biāo)記抗體，鐵蛋白含有2000―3000個(gè)鐵原子的致密鐵離子核心，形成四個(gè)圓形致密區(qū)，所以，具有較高的電子密度，易于電鏡觀察。
***免疫自顯影法
?????同位素標(biāo)記
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?免疫組化---染色方法
即直接法：
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?????標(biāo)記物（熒光素和酶等）直接標(biāo)記特異性抗體
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（一抗），標(biāo)記抗體和抗原結(jié)合
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間接法：
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?????標(biāo)記物（熒光素和酶等）標(biāo)記在二抗上，通過一
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抗與抗原結(jié)合
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抗體橋法：
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?????標(biāo)記三抗，二抗為未標(biāo)記橋抗體
?PAP法（Peroxidase-Antiperoxidase Method?過氧化物酶-抗過氧化物酶）?
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一抗 + 二抗 + PAP復(fù)合物（HRP + 抗HRP抗體[與
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一抗統(tǒng)一種屬]）+ HRP底物顯色?
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?SP法（Streptavidin-Peroxidase Methed?鏈霉親和素-過氧化物酶法）
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??? 一抗 + 生物素標(biāo)記二抗 + HRP標(biāo)記鏈霉親和
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素 + HRP底物顯色
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?ABC法（Avidin-Biotin-peroxidase Complex Method?親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物）
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?? 一抗 + 生物素標(biāo)記二抗 + ABC復(fù)合物（親和素
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- HRP標(biāo)記生物素）+ HRP底物顯色
SABC法?(Streptavidin-Biotin-peroxidase
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Complex Methed?鏈霉親和素-生物素-過氧化
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物酶法) ?
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一抗 + 生物素標(biāo)記二抗 + SABC復(fù)合物（鏈霉親和素+ HRP
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標(biāo)記生物素）+ HRP底物顯色
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免疫組化中常用的組織和細(xì)胞標(biāo)
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本
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?組織標(biāo)本
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??? -石蠟切片
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??? -冰凍切片
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?細(xì)胞標(biāo)本
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?? -組織印片
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?? -細(xì)胞培養(yǎng)片(細(xì)胞爬片)
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?? -細(xì)胞涂片
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免疫組化實(shí)驗(yàn)流程---石蠟切片、間
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接法
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樣品準(zhǔn)備
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取材
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?*標(biāo)本新鮮：一般在2h以內(nèi)進(jìn)行，超過2h，
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組織將有不同程度的自溶，其抗原或變性消
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失，或嚴(yán)重彌散。
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?*取材部位：除取病灶或含待檢抗原部位
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外，還應(yīng)取病灶與正常交界處，即所取組織
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切片中同時(shí)應(yīng)有抗原陽性和陰性區(qū)，以形成
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自身對照。
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?-細(xì)胞壞死后，不僅抗原彌散或消失，而且
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常引起非特異著色，干擾觀察，因此取材時(shí)
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應(yīng)盡可能避開壞死區(qū)。
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固定
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?定義：應(yīng)用各種方法使組織樣本盡量保持其離體前
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狀態(tài)的過程稱為固定（fixation）
。
?固定的作用：從組織學(xué)的角度其簡單的定義是，保
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持細(xì)胞、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，而從免疫組化技
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術(shù)的角度，固定的作用：是使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝
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固，盡量減少或終止外源性酶和內(nèi)源性酶的反應(yīng)；
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防止細(xì)胞的自溶，以免使抗原擴(kuò)散至組織間質(zhì)；以
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保持組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)；更重要的是保持組織
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或細(xì)胞的抗原性，不但要使抗原不導(dǎo)致失活，而且
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不使抗原發(fā)生彌散的現(xiàn)象，才能在免疫組化染色
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時(shí)，不產(chǎn)生過深的背景，影響對陽性物的判斷
。
?組織固定越新鮮越好。組織一經(jīng)離體，就能及時(shí)地
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固定，這是最好的。
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固定液
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對不同類型的組織應(yīng)適當(dāng)合理地選擇固定液。固定劑的種
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類繁多，成份復(fù)雜，對組織的作用不盡相同。在科研實(shí)驗(yàn)
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中，對于組織的固定，應(yīng)有針對性的選擇，方能獲得滿意
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的效果。
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??? 較好的固定液應(yīng)具有強(qiáng)滲透力，能迅速滲入至組織內(nèi)
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部；其次不會(huì)使組織發(fā)生過度收縮變形，并能使組織內(nèi)易
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觀察的成分得以凝固為不溶性物質(zhì)；還要使組織達(dá)到一定
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硬度，有較好的折光率。固定液分為簡單固定液和混合固
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定液
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簡單固定液
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?? 1.?甲醛（formaldehyde）
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??? 是無色氣體，易溶于水成為甲醛溶液。易揮發(fā)，且有
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強(qiáng)烈刺激氣味，常用得是37％～40％的甲醛溶液，商品名
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為福爾馬林（formalin）。用作固定的濃度習(xí)慣為10％福
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爾馬林，實(shí)際含甲醛4％。
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??? 10％福爾馬林滲透力強(qiáng)，固定均勻，對組織收縮少。
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對脂肪、神經(jīng)及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定
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劑。經(jīng)福爾馬林固定時(shí)間長的組織，易產(chǎn)生黑色的沉淀，
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稱福爾馬林色素，影響染色效果。
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2. 4％中性甲醛固定液：常用的固定液，能滿足常規(guī)HE及
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免疫組化工作。中性甲醛是以?pH 7.2～7.4的***酸緩沖液
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為溶劑配制的，其固定效果及對組織抗原性的保存均優(yōu)
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于一般的4％甲醛固定液。
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? 3.乙醇固定液：使用時(shí)以80％～95％的濃度為宜，具有硬
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化、固定、脫水等作用，對組織滲透力較弱，因此很少單
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獨(dú)使用，
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? 4. 4％?多聚甲醛
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?????? Paraformaldehyde?多聚甲醛?(CH2O)n?易溶于堿性條件
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??????使用PBS配置，可用NaOH 調(diào)節(jié)PH促溶
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???? 多聚甲醛不穩(wěn)定，存在解聚的 過程，4度 一兩周之
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內(nèi)使用完比較好， -20度 一年內(nèi)不受影響 ，建議現(xiàn)配現(xiàn)
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用。
???? 多聚甲醛易溶于脂類物質(zhì)，因此能穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)
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胞內(nèi)。用多聚甲醛固定細(xì)胞時(shí)，能使細(xì)胞內(nèi)的自由氨基基
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團(tuán)發(fā)生化學(xué)交聯(lián)。當(dāng)不同的分子發(fā)生交聯(lián)時(shí)，形成一網(wǎng)狀
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結(jié)構(gòu)，把細(xì)胞的各個(gè)結(jié)構(gòu)成分連接起來。
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免疫組化常用多聚甲醛和中性緩沖甲醛作為固定液；
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混合固定液
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?簡單固定液只是對細(xì)胞的某些成分固定較好，而不
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能將所有成分都保存下來。相互配合使用能取長補(bǔ)
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短，得到比較好的固定效果。
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?乙醇一甲醛(乙醇－福爾馬林，AF)固定液：該固
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定液有固定兼脫水作用，固定后的標(biāo)本可直接入
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95％乙醇脫水。
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?B5(醋酸鈉一升*一甲醛)固定液：多用于固定淋巴
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組織。染色前應(yīng)進(jìn)行脫*沉淀處理。
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?Bouin固定液：對組織固定較均勻，收縮很少，不
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會(huì)使組織變硬變脆。需現(xiàn)配現(xiàn)用。
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?Carnoy固定液：穿透能力強(qiáng)，可很好的固定細(xì)胞
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質(zhì)和細(xì)胞核，特別適合于固定外膜致密的組織，亦
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適用于糖原及尼氏小體的固定。
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?總之固定液的種類很多，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩磉x擇
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合適的固定液。
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組織脫水
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?為保證石蠟有可能進(jìn)入組織內(nèi)部，采用適當(dāng)方法，
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將已固定和水洗過的組織中的水分徹底驅(qū)除的過程
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稱為脫水（dehydration）。脫水劑必須是與水
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在任何比例均能混合的液體。最常用的脫水劑為乙
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醇，其它尚有正丁醇和二氧已環(huán)以及丙***等。
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?脫水用的乙醇濃度一般從70％~75％開始，然后依
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次80％→95％→100％，即
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由低濃度逐步到高濃度。脫水的時(shí)間與組織大小、
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厚薄有關(guān)系、組織厚?大，脫水時(shí)間要長些；而小
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薄的組織脫水時(shí)間相對的可以短些。
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?脫水不完全，將可引起一系列的問題，比如浸蠟不
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徹底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，
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導(dǎo)致后來切片
地 址： 北京市北京經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)環(huán)科中路16號(hào)26幢3層301
聯(lián)系人： 索萊寶-龔思雨
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