聚乙二醇主鏈ELISA試劑盒使用說明書
用于測(cè)量聚乙二醇和聚乙二醇結(jié)合蛋白的ELISA試劑盒在使用操作ELISA試劑盒之前，請(qǐng)務(wù)必先徹讀以下介紹。
使用目的：該試劑盒僅供科研用途使用。任何情況下都不得用于治療或診斷用途
介紹：生物制品通過與聚乙二醇結(jié)合，延緩了蛋白質(zhì)降解，降低了被循環(huán)系統(tǒng)清除的速率，從而延長了半衰期（參考文獻(xiàn)1）。聚乙二醇結(jié)合蛋白的藥物動(dòng)力學(xué)通常使用特異性檢測(cè)蛋白質(zhì)含量來評(píng)估確認(rèn)。該方法不僅耗時(shí)，而且需要開發(fā)昂貴的針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法（ELISA）。由Life Diagnostics生產(chǎn)的聚乙二醇 ELISA 試劑盒，可以測(cè)量聚乙二醇結(jié)合蛋白中的聚乙二醇部分，因此適合一些列聚乙二醇結(jié)合蛋白的藥物動(dòng)力學(xué)評(píng)估。
背景：檢測(cè)方法為直接競(jìng)爭性ELISA法。 BSA (牛血清白蛋白) 與甲氧基聚乙二醇單鏈通過共價(jià)鍵結(jié)合，涂布在96孔板的微孔中。經(jīng)稀釋的樣品和含有聚乙二醇結(jié)合蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶(50μl) 加入微孔中。然后將辣根過氧化酶結(jié)合抗-PEG抗體（50μl）添加到孔中，并將孔板在孔板振蕩器上培養(yǎng)1小時(shí)。洗滌微孔后，將 TMB (100 μl HRP酶底物), 添加到孔中培養(yǎng)20分鐘, 形成藍(lán)色。加入1N鹽酸 (100 μl)停止顯色，此時(shí)溶液顏色轉(zhuǎn)為黃色，測(cè)定450nm處的吸光度。如果樣品中存在聚乙二醇，會(huì)和板上固化的聚乙二醇爭奪與HRP結(jié)合抗聚乙二醇抗體的結(jié)合，從而導(dǎo)致吸光度值下降。 ELISA試劑盒中使用的抗體是由Life Diagnostics 開發(fā)的小鼠單克隆抗體 (clone 1D9-6) ，對(duì)聚乙二醇主鏈具有特異性。Life Diagnostics的研究表明該試劑盒可用于檢測(cè)包含一條或多條的聚乙二醇鏈的蛋白質(zhì)，也可以檢測(cè)未結(jié)合的聚乙二醇。 靈敏度隨著聚乙二醇鏈長和聚合度的不同而變化 （參見表1），因此推薦生成一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于檢測(cè)不同的聚乙二醇或聚乙二醇結(jié)合分子。試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品，是結(jié)合了單條20kDa甲氧基聚乙二醇鏈的BSA. 因此終端用戶可以籍此確認(rèn)試劑盒的性能。
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PEG
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EC50 (ng/ml)
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BSA-(mPEG 20 kDa)3-7
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1.0 +/- 0.1
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BSA-mPEG 20 kDa
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3.6 +/- 0.5
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BSA-PEG 10 kDa
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9.4 +/- 1.1
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BSA-mPEG 5 kDa
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111 +/- 22
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20 kDa mPEG
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0.70 +/- 0.15
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10 kDa PEG
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0.59 +/- 0.16
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5 kDa mPEG
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4.65 +/- 2.32
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表1. 高靈敏度聚乙二醇ELISA試劑盒中聚乙二醇結(jié)合BSA和未結(jié)合聚乙二醇的特征值。 請(qǐng)注意聚乙二醇結(jié)合BSA的濃度僅指多肽部分，而不包括由聚乙二醇引入的物質(zhì)。EC50值指的是由3-6次檢測(cè)得到的 +/- SD的平均值。
儲(chǔ)存： 收到HRP抗聚乙二醇抗體小瓶后，聚乙二醇結(jié)合BSA標(biāo)準(zhǔn)品和PEG涂布的96孔板應(yīng)即刻置于-20℃的冷凍箱中保存直至使用。請(qǐng)勿置于更低的溫度下保存。試劑盒的其余組成應(yīng)置于2-8℃的冰箱中保存。微量檢測(cè)條應(yīng)置于包含干燥劑的密封袋中保存，以盡可能避免潮濕空氣影響。如試劑盒部件按上述方法妥善保存，測(cè)試試劑盒自購買之日起，保持穩(wěn)定6個(gè)月。在使用前，孔板，稀釋劑和TMB試劑應(yīng)平衡至室溫，這點(diǎn)很重要。
物料
試劑盒提供的物料：
- 涂布聚乙二醇的 Microtiter 96孔板 (12 條8孔可拆卸板條)。-20℃下保存。
- HRP結(jié)合抗聚乙二醇抗體, 1 小瓶。 -20℃下保存。
- HRP結(jié)合聚乙二醇稀釋劑, 50 ml
- PEG-BSA標(biāo)準(zhǔn)品, 1小瓶。* -20℃下保存。
- HRP PEG洗滌緩沖液 (20x stock), 50 ml
- TMB試劑, 11 ml
- 終止液, 11 ml
需要用到但試劑盒未包含的物料：
- 精密移液器和吸頭
- 蒸餾水或去離子水
- 聚丙烯管或玻璃管
- 漩渦混合器
- 吸水紙或紙巾
- 微孔板培養(yǎng)箱/振蕩篩 (混合速率 ~150 rpm)
- 洗板機(jī)
- 讀板器，450nm下光密度范圍0-4
- 繪圖軟件
試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品的制備
- 將8個(gè)聚丙烯管或玻璃管分別標(biāo)記為1000, 200, 40, 8, 1.6, 0.32, 0.064 和0 ng/ml。
- 按照PEG標(biāo)準(zhǔn)品小瓶標(biāo)簽上的方法制備1000 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液。
- 分別將200μl稀釋液加入標(biāo)有200、40、8、1.6、0.32、0.064和0 ng/ml的試管中。
- 將1000 ng/ml的PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液用移液器轉(zhuǎn)移50 μl轉(zhuǎn)移至標(biāo)有200 ng/ml的試管中并混合均勻。由此獲得 200 ng/ml PEG-BSA 工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。
- 依次進(jìn)行類似的5倍稀釋可分別制備40, 8, 1.6, 0.32 和 0.064 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
樣品制備
聚乙二醇結(jié)合蛋白在血清或血漿里的濃度與許多因素有關(guān)：注射途徑，注射量，注射后收集血清或血漿的時(shí)間。由于這些變量都是由用戶確定的，因此需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定最佳的稀釋程度。
HRP 結(jié)合抗-PEG抗體制備
確定所需結(jié)合物的體積 (0.5 ml 每 8個(gè)孔板條帶) ，然后按小瓶標(biāo)簽標(biāo)示使用稀釋溶液稀釋HRP結(jié)合抗-PEG抗體。制備后應(yīng)盡快使用。
洗滌溶液制備
洗滌溶液是以20倍貯存液的形式提供。使用950毫升蒸餾水或去離子水稀釋瓶內(nèi)容物（50毫升）。
分析過程
- 確保涂布板孔的數(shù)量足夠用。
- 將50μl標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入孔內(nèi)（建議標(biāo)準(zhǔn)品和樣品一式三份進(jìn)行測(cè)試）。
- 向每個(gè)孔中加入50μl的HRP結(jié)合抗-PEG抗體。
- 在室溫（25°C）下，以150轉(zhuǎn)/分的速率在微型平板振動(dòng)篩上培養(yǎng)1小時(shí)。
- 使用洗板機(jī)，用400μl清洗緩沖液清洗板孔共6次。
- 用吸水紙或紙巾充分擦拭板孔，以去除殘留液滴。
- 將100μl TMB試劑加入各個(gè)板孔。
- 以150轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速在微板振動(dòng)篩上輕輕混合20分鐘。
- 加入100μl終止溶液到每個(gè)板孔，來停止反應(yīng)。
- 輕輕混合，直到所有藍(lán)色變成黃色。
- 在5分鐘內(nèi)用孔板讀數(shù)器讀取450 nm處的吸光度。
結(jié)果計(jì)算
使用計(jì)算機(jī)圖形軟件用于結(jié)果計(jì)算。
- 計(jì)算每組參考標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度平均值(A450)。
- 通過測(cè)得的每個(gè)參考標(biāo)準(zhǔn)品的平均吸光度，與其濃度以10為底的對(duì)數(shù)log10（ng/ml）的比值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，垂直軸或Y軸為吸光度，水平軸或X軸為濃度。
- 將數(shù)據(jù)擬合到Sigmoidal函數(shù)量效關(guān)系模型（可變斜率）。曲線上限可以用0 ng/ml空白標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定值修正，曲線下限可以用1000 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定值修正。
- 根據(jù)每個(gè)樣品的平均吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到相應(yīng)聚乙二醇化蛋白質(zhì)以10為底的對(duì)數(shù)濃度，并通過逆以10為底對(duì)數(shù)計(jì)算得出濃度（ng/ml）。
- 強(qiáng)烈建議僅使用標(biāo)準(zhǔn)曲線中間50%范圍內(nèi)的樣品吸光度值來確定PEG濃度。例如，如果吸光度的下限（0 ng/ml）和上限值分別為1.6和0.1，則僅采用位于1.225和0.475范圍內(nèi)的樣品吸光度值。
- 用推導(dǎo)出的濃度乘以稀釋因子，以確定血清/血漿樣本中聚乙二醇化蛋白質(zhì)的實(shí)際濃度。
- 如果樣品的A450值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的有效范圍，則應(yīng)適當(dāng)稀釋樣品并重新測(cè)試。
典型標(biāo)準(zhǔn)曲線
下面顯示了一個(gè)典型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在Y軸上的在450nm的吸光度讀數(shù)，在X軸上為?20 kDa?BSA-甲氧基聚乙二醇的濃度。請(qǐng)注意，X軸是以10為底的對(duì)數(shù)刻度。
峰值/回收率數(shù)據(jù)
Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠）血清加入了所示濃度的20 kDa?BSA-甲氧基聚乙二醇，回收率則使用PEG-ELISA P-0003進(jìn)行估算。
發(fā)現(xiàn)正常大鼠血清中含有可測(cè)量的聚乙二醇，可能來自膳食來源。
重要提示
- 切勿將疊氮化物作為防腐劑添加到血清或血漿樣本中。疊氮化物是HRP的抑制劑，會(huì)使分析無效。
推薦使用洗板機(jī)用于微孔板清洗。僅使用試劑盒提供的清洗緩沖液。在使用前用蒸餾水或去離子水洗滌洗板機(jī)所有的管道和器皿，并用清洗緩沖液徹底洗滌。 - 制備標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，通常使用多道移液器在空白聚丙烯96孔板上進(jìn)行恰當(dāng)?shù)倪B續(xù)稀釋操作。樣品也同樣制備，并/或分配到空白96孔板用于酶聯(lián)免疫的位置。這樣使用多道移液器可保樣品和標(biāo)準(zhǔn)品快速簡便地轉(zhuǎn)移到酶聯(lián)板上。
- 如使用試劑盒之外的標(biāo)準(zhǔn)品，建議使用10倍稀釋液來確定標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，從10 μg/ml濃度開始。?使用單條8孔板條，可毫不費(fèi)力地確定從0.1 ng/ml到10 μg/ml 濃度范圍。然后通過微調(diào)獲得可用的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。
- 所有試劑在使用前必須達(dá)到室溫（18-25攝氏度）。
- 在添加HRP結(jié)合抗PEG抗體之前，始終先將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品添加到微孔中。
- 請(qǐng)勿使用自備緩沖液替代試劑盒提供的緩沖液（例如稀釋液或洗滌緩沖液）。許多市售材料含有聚乙二醇或聚乙二醇結(jié)合分子，這將影響試劑盒的性能。因此，應(yīng)小心選擇用于聚乙二醇結(jié)合蛋白研究的其他組份。
- 吐溫-20是一種含有聚乙二醇的洗滌劑，常用于ELISA稀釋和洗滌緩沖液。它會(huì)干擾本酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)盒。其他聚乙二醇洗滌劑亦如是。
- 不要把疊氮化物作為防腐劑添加到血清或血漿樣本中。疊氮化物是HRP的抑制劑，會(huì)使分析無效。
- 強(qiáng)烈推薦使用洗板機(jī)清洗微孔。務(wù)必使用試劑盒附帶的清洗緩沖液。使用前用蒸餾水或去離子水清洗洗板機(jī)的所有管路和容器，并用清洗緩沖液徹底清洗洗板機(jī)。
- 制備標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，通常使用多道移液器在空白PS 96孔板中進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪B續(xù)稀釋。樣品制備和/或分配到在ELISA中預(yù)置的空白96孔板中。使用多道移液器將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品快速簡便地轉(zhuǎn)移到ELISA板上。
- 如采用試劑盒預(yù)置以外的標(biāo)準(zhǔn)品，建議使用10倍稀釋液來確定標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，起始濃度從10μg/ml開始。使用單個(gè)8孔板條，濃度范圍0.1 ng/ml至10μg/ml的檢測(cè)會(huì)更便宜些。然后再微調(diào)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。
參考文獻(xiàn)
1. Webster R, et al. PEGylated Proteins: Evaluation of their safety in the absence of definitive metabolism studies. Drug Metabolism and Disposition 35:9-16 (2007)
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