?細(xì)胞內(nèi)抗原染色——間接標(biāo)記
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A. 所需溶液和試劑
1. 磷酸鹽緩沖液 (C01-01002)：0.1M PH7.4 1X PBS
2. 固定液：4%多聚甲醛溶液（無甲醇）(C01-06001)；1%多聚甲醛溶液（無 甲醇）（C03-02001） 3. 穿膜劑(C01-03001)：0.3% tritonX-100
4. 抗體封閉液（C03-03001）：10%山羊血清溶液
5. 孵育緩沖液(C03-03002)：2% BSA 的 0.1M PBS
6. 抗體稀釋液(C01-04001)：1% BSA, 0.03% Proclin300 的 0.1M PBS
B. 樣本處理——固定穿膜?
1. 離心收集細(xì)胞，棄上清。
2. 將細(xì)胞重懸在 1 ml PBS(C01-01002)中。加入等體積甲醛溶液(C01-06001) 至終濃度為 2%，37°C 固定 10 分鐘。（或者用 70%的冰乙醇 5-10ML ,4℃ 固定 16 小時）
3. 放在冰上降溫 1 分鐘后加入 1 X PBS ，800rpm 離心 5min 去上清，重復(fù)一 次。
4. 細(xì)胞漿內(nèi)抗體用 0.3% tritonX-100(C01-03001) 穿膜 5 分鐘（若細(xì)胞核內(nèi)的 抗體標(biāo)記，用 90%的冰甲醇穿膜 30 分鐘）。
C. 抗體標(biāo)記
1. 將 0.5-1 x 106 個細(xì)胞分到各檢測管中（依照體積）。
2. 各管加入 2 ml PBS(C01-01002)，200g 離心 5 分鐘, 回收細(xì)胞。重復(fù)一次。
3. 向每支檢測管中加入 100μl 孵育緩沖液 (C03-03002)重懸細(xì)胞。
4. 向每支樣品管中加入經(jīng)抗體稀釋液(C01-04001)按合適比例稀釋后的未標(biāo) 記、生物素標(biāo)記一抗，室溫孵育 30 分鐘。
5. 加入 2 ml 孵育緩沖液，200g 離心 5 分鐘，離心回收細(xì)胞；重復(fù)一次。
6. 向每只檢測管中加入 100μl 孵育緩沖液 (C03-03002)重懸細(xì)胞后加入 100μl 10%山羊血清的孵育緩沖液中（C03-03001），室溫，封閉 15 分鐘。
7. 加入一定比例稀釋的熒光素二抗。室溫孵育 40 分鐘。
8. 同第步驟 5。
9. 將細(xì)胞重懸在 1%多聚甲醛溶液（C03-02001）中然后用流式細(xì)胞儀檢測。
注意：
1.甲醛溶液加入量為 1X106 cells / m L。
2.冰乙醇與冰甲醇的加入方法： 向細(xì)胞中逐滴加入冰乙醇；向細(xì)胞中緩慢加入冰甲醇。
3.同型對照的設(shè)置。
4.標(biāo)記前細(xì)胞計數(shù)。