免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)
血清學(xué)技術(shù)
抗原抗體反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)的抗體之間發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。它既可以發(fā)生在體內(nèi)，也可以發(fā)生在體外。在體內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)是體液免疫應(yīng)答的效應(yīng)作用。體外的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)主要用于檢測(cè)抗原或抗體，用于免疫學(xué)診斷。因抗體主要存在于血清中，所以將體外發(fā)生的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)或血清學(xué)試驗(yàn)。血清學(xué)試驗(yàn)具有高度的特異性，廣泛應(yīng)用于微生物的鑒定、傳染病及寄生蟲(chóng)病的診斷和監(jiān)測(cè)。
2 特點(diǎn)：
（一）特異性和交叉性?抗原抗體的特異性結(jié)合是指抗原分子上的抗原決定簇和抗體分子可變區(qū)結(jié)合的特異性，是由兩者之間空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)決定的。抗原與相應(yīng)抗體的結(jié)合具有高度的特異性，主要依靠抗原分子上的抗原決定簇和抗體末端可變區(qū)的氨基酸排列和立體構(gòu)型，只有抗原決定簇的立體構(gòu)型和抗體分子的立體構(gòu)型完全吻合，才能發(fā)生反應(yīng)。如抗新城疫病毒的抗體只能與新城疫病毒結(jié)合，而不能與其他病毒結(jié)合。但較大分子的蛋白質(zhì)常含有多種抗原決定簇，如果兩種不同的抗原之間含有部分共同的抗原決定簇，則發(fā)生交叉反應(yīng)。如腸炎沙門氏菌的抗血清能凝集鼠傷寒沙門氏菌。一般來(lái)說(shuō)親緣關(guān)系越近，交叉反應(yīng)的程度越高。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)高度特異性的特點(diǎn)，在疾病診斷中可用抗原、抗體任何一方作為已知條件來(lái)檢測(cè)另一未知方。
（二）敏感性
抗原抗體的結(jié)合還具有高度敏感性的特點(diǎn)，不僅可檢測(cè)定性，還可以定量檢測(cè)微量、極微量的抗原或抗體，其敏感度大大超過(guò)當(dāng)前所應(yīng)用的化學(xué)分析方法。
（三）可逆性
抗原與抗體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合是可逆的，結(jié)合條件為0℃～40℃、pH4～9。如溫度超過(guò)60℃或pH降到3以下，或加入解離劑（如硫*化鉀、尿素等）時(shí)，則抗原抗體復(fù)合物又可重新解離，并且分離后抗原或抗體的性質(zhì)仍不改變。免疫技術(shù)中的親合層析法，常用改變pH和離子強(qiáng)度促使抗原抗體復(fù)合物解離，從而純化抗原或抗體。
（四）反應(yīng)的二階段性
第一階段為抗原與抗體的特異性結(jié)合階段，此階段反應(yīng)快、僅數(shù)秒至數(shù)分鐘，但不出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。第二階段為可見(jiàn)階段，這一階段抗原抗體復(fù)合物在環(huán)境因素（如電解質(zhì)、pH、溫度、補(bǔ)體）的影響下出現(xiàn)各種可見(jiàn)反應(yīng)，如表現(xiàn)為凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合等。此階段反應(yīng)慢、需數(shù)分鐘、數(shù)十分鐘或更久。第二階段受電解質(zhì)、pH、溫度等因素的影響。
（五）最適比例與帶現(xiàn)象
大多數(shù)抗體為二價(jià)，抗原為多價(jià)，因此只有兩者比例合適時(shí)，才能形成彼此連接的大復(fù)合物，血清學(xué)反應(yīng)才出現(xiàn)凝集、沉淀等可見(jiàn)的反應(yīng)現(xiàn)象（圖11-1）。如果抗原過(guò)多或抗體過(guò)多，則抗原與抗體的結(jié)合不能形成大復(fù)合物，抑制可見(jiàn)反應(yīng)的出現(xiàn)，稱為帶現(xiàn)象。當(dāng)抗體過(guò)量時(shí)，稱為前帶；抗原過(guò)多時(shí)，稱為后帶。為克服帶現(xiàn)象，在進(jìn)行血清學(xué)反應(yīng)時(shí)，需將抗原或抗體作適當(dāng)稀釋，通常是固定一種成分，稀釋另一種成分。
（六）用已知測(cè)未知
所有的血清學(xué)試驗(yàn)都是用已知抗原測(cè)定未知抗體，或用已知抗體測(cè)定未知抗原。在反應(yīng)中只能有一種材料是未知的，但可以用兩種或兩種以上的已知材料檢測(cè)一種未知抗原或抗體。
3 影響因素
（一）電解質(zhì)
抗原與抗體發(fā)生結(jié)合后，由親水膠體變?yōu)槭杷z體的過(guò)程中，須有電解質(zhì)參與才能進(jìn)一步使抗原抗體復(fù)合物表面失去電荷，水化層破壞，復(fù)合物相互靠攏聚集形成大塊的凝集或沉淀。若無(wú)電解質(zhì)參加，則不出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。為了促使沉淀物或凝集物的形成，常用0.85%～0.9%（人、畜）或8%～10%（禽）的氯化鈉或各種緩沖液（免疫標(biāo)記技術(shù)）作為抗原和抗體的稀釋液或反應(yīng)液。但電解質(zhì)的濃度不宜過(guò)高，否則會(huì)出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。
（二）溫度
在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，抗原、抗體分子運(yùn)動(dòng)速度越快，這可以增加其碰撞的機(jī)會(huì)，加速抗原抗體結(jié)合和反應(yīng)現(xiàn)象的出現(xiàn)，如凝集和沉淀反應(yīng)通常在37℃水浴感作（即將試驗(yàn)材料加蓋保濕恒溫作用）一定時(shí)間，以促進(jìn)反應(yīng)現(xiàn)象的出現(xiàn)，若用56℃水浴則反應(yīng)更快。但有的抗原抗體結(jié)合則需長(zhǎng)時(shí)間在低溫下，才能使反應(yīng)完成的比較充分、徹底，如有的補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)在0℃～4℃冰箱結(jié)合效果更好。
（三）酸堿度
血清學(xué)試驗(yàn)要求在一定的pH下進(jìn)行，常用的pH值為6～8，過(guò)高或過(guò)低，均可使已結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物重新解離。若pH降至抗原或抗體的等電點(diǎn)時(shí)，會(huì)發(fā)生非特異性的酸凝集，造成假象。
（四）振蕩
適當(dāng)?shù)臋C(jī)械振蕩能增加分子或顆粒間的相互碰撞，加速抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)，但強(qiáng)烈的振蕩可使抗原抗體復(fù)合物解離。
（五）雜質(zhì)和異物
試驗(yàn)介質(zhì)中如有與反應(yīng)無(wú)關(guān)的雜質(zhì)、異物（如蛋白質(zhì)、類脂質(zhì)、多糖等物質(zhì)）存在時(shí)，會(huì)抑制反應(yīng)的進(jìn)行或引起非特異性反應(yīng)，故每批血清學(xué)試驗(yàn)都應(yīng)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照試驗(yàn)。
4 實(shí)驗(yàn)方法：
凝集反應(yīng)（agglutination reaction）
一種血清學(xué)反應(yīng)。顆粒性抗原（完整的病原微生物或紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有電介質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集小塊。參與凝集反應(yīng)的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。可分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)兩類。
直接凝集反應(yīng)
顆粒狀抗原（如細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體直接結(jié)合所出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。分為玻片法和試管法。玻片法是一種定性試驗(yàn)方法。可用已知抗體來(lái)檢測(cè)未知抗原。若鑒定新分離的菌種時(shí)，可取已知抗體滴加在玻片上，將待檢菌液一滴與其混勻。數(shù)分種后，如出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象，為陽(yáng)性反應(yīng)。該法簡(jiǎn)便快速，除鑒定菌種外，尚可用于菌種分型、測(cè)定人類紅細(xì)胞的ABO血型等。試管法是一種定量試驗(yàn)的經(jīng)典方法。可用已知抗原來(lái)檢測(cè)受檢血清中有無(wú)某抗體及抗體的含量。用來(lái)協(xié)助臨床診斷或供流行病學(xué)調(diào)查研究。操作時(shí)，將待檢血清用生理鹽水連續(xù)成倍稀釋，然后加入等量抗原，最高稀釋度仍有凝集現(xiàn)象者，為血清的效價(jià)，也稱滴度，以表示血清中抗體的相對(duì)含量。診斷傷寒、副傷寒病的肥達(dá)氏反應(yīng)（Widaltest）、布氏病的瑞特氏反應(yīng)（Wright test）均屬定量凝集反應(yīng)。
間按凝集反應(yīng)
將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與免疫無(wú)關(guān)的、一定大小的顆粒狀載體的表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用。在有電介質(zhì)存在的適宜條件下，即可發(fā)生凝集，稱為間接凝集反應(yīng)。用做載體的微球可用天然的微粒性物質(zhì)，如人（O型）和動(dòng)物（綿羊、家兔等）的紅細(xì)胞、活性炭顆粒或硅酸鋁顆粒等；也可用人工合成或天然高分子材料制成，如聚苯乙烯膠乳微球等。由于載體顆粒增大了可溶性抗原的反應(yīng)面積，當(dāng)顆粒上的抗原與微量抗體結(jié)合后，就足以出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)，敏感性比直接凝集反應(yīng)高得多。
沉淀反應(yīng)(preclpltation reaction)
可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適量電介質(zhì)存在下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，形成肉眼可見(jiàn)的沉淀物。沉淀反應(yīng)的抗原可以是多糖、蛋白質(zhì)、類脂等。同相應(yīng)抗體比較，抗原的分子小，單位體積內(nèi)含有的抗原量多，做定量試驗(yàn)時(shí)，為了不使抗原過(guò)剩，應(yīng)稀釋抗原，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價(jià)。習(xí)慣上將參與沉淀反應(yīng)的抗原稱為沉淀原，抗體稱沉淀素。沉淀反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法大體可分為環(huán)狀法、絮狀法、瓊脂擴(kuò)散法三種基本類型。
環(huán)狀沉淀又稱環(huán)狀試驗(yàn)。主要用于抗原的定性試驗(yàn)。用已知抗體來(lái)檢測(cè)未知抗原。在小口徑試管中先加入已知抗血清，然后將待檢抗原小心地加在血清的表面，成為界面清晰的兩層。數(shù)分鐘后，兩界面交界處出現(xiàn)白色沉淀環(huán)，為陽(yáng)性反應(yīng)。本試驗(yàn)常用做抗原定性，如炭疽的診斷（Ascoli氏試驗(yàn)）、鑒別血跡、媒介昆蟲(chóng)的嗜血性等。
絮狀沉淀
將抗原與相應(yīng)抗體在試管內(nèi)或凹玻片上混勻，如出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的絮狀沉淀物，為陽(yáng)性反應(yīng)。如診斷梅毒的康氏反應(yīng)（Kahntest）。
瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)
利用可溶性抗原與抗體在半固體瓊脂內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)散，若抗原與抗體對(duì)應(yīng)，并且比例適當(dāng)，就會(huì)出現(xiàn)白色沉淀線，此為陽(yáng)性反應(yīng)。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)可在試管內(nèi)、平皿中以及玻片上的瓊脂中進(jìn)行。又可分為單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)兩類。
單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)
是一種常用的定量檢測(cè)抗原的方法。將適量抗體與瓊脂混勻，澆注成板，凝固后，在板上打孔，孔中加入抗原，抗原就會(huì)向孔的四周擴(kuò)散，邊擴(kuò)散邊與瓊脂中的抗體結(jié)合。一定時(shí)間后，在兩者比例適當(dāng)處形成白色沉淀環(huán)。沉淀環(huán)的直徑與抗原的濃度成正比。如事先用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，則從曲線中可求出標(biāo)本中抗原的含量。本試驗(yàn)主要用于檢測(cè)標(biāo)本中各種免疫球蛋白和血清中各種補(bǔ)體成分的含量，敏感性很高。
雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)
是將半固體瓊脂傾注于平皿內(nèi)或玻片上，待其凝固后，在瓊脂板上打孔，將抗原、抗體分別注入小孔內(nèi)，使兩者相互擴(kuò)散。如果抗原、抗體相互對(duì)應(yīng)，濃度、比例適當(dāng)，則一定時(shí)間后，在抗原、抗體孔之間出現(xiàn)清晰可見(jiàn)的沉淀線。雙向瓊脂擴(kuò)散法可用來(lái)分析溶液中的多種抗原。一對(duì)抗原、抗體系統(tǒng)只能形成一條沉淀線，不同的抗原抗體系統(tǒng)在瓊脂中擴(kuò)散的速度不同，可在瓊脂中形成不同的沉淀線。本法主要是用于檢測(cè)血清中各種免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙肝表面抗原等。缺點(diǎn)是需要時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，靈敏度不高。