搖瓶培養(yǎng)技術(shù)問世后，由于其簡(jiǎn)便、實(shí)用，很快便被發(fā)展成為微生物培養(yǎng)中極重要的技術(shù)而普及，并廣泛用于工業(yè)微生物菌種篩選、實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模發(fā)酵試驗(yàn)、種子培養(yǎng)等。
Question 1：搖瓶的培養(yǎng)設(shè)備有哪些？
NEST：根據(jù)震蕩方式分類，搖瓶培養(yǎng)設(shè)備主要有旋轉(zhuǎn)式搖床和往復(fù)式搖床兩種類型，也有旋轉(zhuǎn)式和往復(fù)式的混合類型, 其中以旋轉(zhuǎn)式最為常用。
NEST 耐CO2水平搖床
NEST 試管旋轉(zhuǎn)混勻器
用旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行微生物振蕩培養(yǎng)時(shí)，固定在搖床上的三角燒瓶隨搖床以 200～250r/min 的速度運(yùn)動(dòng)，由此帶動(dòng)培養(yǎng)物圍繞著三角燒瓶的內(nèi)壁平穩(wěn)地運(yùn)動(dòng)。
振蕩培養(yǎng)中所使用的發(fā)酵容器通常為三角燒瓶，也有使用特殊類型的燒瓶或試管。在振蕩培養(yǎng)過程中所采用的燒瓶類型和振蕩類型主要取決于所要研究的發(fā)酵類型及性質(zhì)。
振蕩培養(yǎng)通常用于有氧過程中，主要是兩種類型：
(1) 供氧相對(duì)較大，以產(chǎn)生大量的細(xì)胞，常見于絲狀微生物 (如食用菌、放線菌) 中；
(2) 需供氧但所需供氧量較小，常見于細(xì)菌。要獲得高氧供應(yīng)，可在較大的燒瓶 (250～500 ml 三角燒瓶) 中盛裝相對(duì)較小容積的培養(yǎng)基，由此可獲得更高的氧傳遞速率，便于細(xì)胞的迅速生長(zhǎng)，要獲得較低的氧供, 則采用較慢的振蕩速度和相對(duì)大的培養(yǎng)體積。
PC錐形搖瓶&高效搖瓶
耐思的高效搖瓶，在傳統(tǒng)搖瓶的基礎(chǔ)上做了改進(jìn)，對(duì)搖瓶底部?jī)?yōu)化，節(jié)約了占用空間，大大提高了搖床的使用率，降低了客戶研發(fā)、生產(chǎn)成本。
可用于懸浮細(xì)胞或者細(xì)菌培養(yǎng)，也可用于培養(yǎng)基配制、混合及儲(chǔ)存。
Question 2：搖瓶的培養(yǎng)設(shè)備有哪些？
NEST：在搖床、搖瓶的選擇等方面都要根據(jù)實(shí)際情況確認(rèn)。
搖瓶培養(yǎng)的機(jī)械裝置主要由用于放置和固定燒瓶的平臺(tái)以及牽引其運(yùn)轉(zhuǎn)的馬達(dá)和運(yùn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)組成，搖瓶需安裝于有維持恒溫和恒濕自動(dòng)調(diào)節(jié)能力的隔熱室內(nèi)。目前也有具備恒溫裝置的小型臺(tái)式搖床。考察搖床的設(shè)計(jì)和使用性能主要從下列幾項(xiàng)入手：
1、所使用的設(shè)備
2、平衡要求
3、搖床的大小、型號(hào)
4、培養(yǎng)條件及恒溫調(diào)控
5、試管或小型發(fā)酵器的振蕩培養(yǎng)性能。
通常，搖床的工作溫度為 25～37℃。由于電機(jī)和機(jī)械傳動(dòng)部分的產(chǎn)熱、振蕩產(chǎn)熱和微生物生長(zhǎng)代謝釋放的熱能，使搖瓶中培養(yǎng)基的實(shí)際溫度要比實(shí)際室溫高 2℃ 左右，且在強(qiáng)烈振蕩時(shí)，此溫差更為明顯。因此, 在實(shí)驗(yàn)過程中設(shè)計(jì)高溫點(diǎn)時(shí)必須認(rèn)真注意到這一問題。
另外，由于夏季氣溫偏高，溫控困難隨之增大。培養(yǎng)放線菌和真菌時(shí)溫控更為主要，因?yàn)榇蟛糠址啪€菌和真菌在 30℃ 下培養(yǎng)時(shí)，其代謝已被嚴(yán)重干擾，而 30℃ 的溫度在搖瓶中是極易形成的。因此, 在搖床室中必須裝配一個(gè)可靠的致冷系統(tǒng)。一般臺(tái)式搖床都有一通過空氣循環(huán)或水浴來保持恒溫的裝置，可使所有的搖瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基溫度處于同一水平。
搖瓶蓋子類型上除了有常規(guī)的密封蓋和透氣蓋，還專門為高效搖瓶設(shè)計(jì)了各種轉(zhuǎn)移蓋。透氣蓋保證了氣體的交換，而特殊的轉(zhuǎn)移蓋，降低了在液體轉(zhuǎn)移及培養(yǎng)過程中的污染風(fēng)險(xiǎn)。
倒置轉(zhuǎn)移蓋同2L3L5L搖瓶配合使用，將進(jìn)液管路與所需設(shè)備進(jìn)行連接
需要轉(zhuǎn)移液體時(shí)，將搖瓶倒置，通過重力來進(jìn)行液體轉(zhuǎn)移
雙向液體轉(zhuǎn)移蓋：
同2L、3L、5L搖瓶配合使用，將進(jìn)液管路與所需設(shè)備進(jìn)行連接，
在搖瓶以及設(shè)備之間連上蠕動(dòng)泵即可實(shí)現(xiàn)液體轉(zhuǎn)移操作，液體轉(zhuǎn)移完，可換上透氣蓋進(jìn)行培養(yǎng)。
多功能液體轉(zhuǎn)移蓋：
多功能轉(zhuǎn)移蓋在液體轉(zhuǎn)移完之后，可以直接放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，能夠滿足較大的空氣通量，
取樣部件由取樣頭與單向閥組成，防止取樣過程中液體逆流，保證了無菌取樣。
進(jìn)液管路自帶PTFE針式濾器，解決了補(bǔ)料過程中管路液體殘留的情況。
還可以直接選擇自帶管路的5L高效搖瓶，省去管路設(shè)計(jì)、組裝、滅菌等操作，提高了生產(chǎn)效率。
Question 3：搖瓶的培養(yǎng)設(shè)備有哪些？
NEST：下面我們就講一下常見問題。
就一特定微生物而言，振蕩培養(yǎng)時(shí)存在最佳培養(yǎng)基配方和最佳培養(yǎng)基容量。一般來說，振蕩培養(yǎng)絲狀微生物時(shí)培養(yǎng)基最佳容量為50～100ml/500ml三角燒瓶，或25～50 ml/250ml三角燒瓶，即為所使用的發(fā)酵容器容積的10～20%。
在這一范圍內(nèi)，所使用培養(yǎng)基量越小，所得試驗(yàn)結(jié)果越好。通過使用帶有擋板的燒瓶、使用氣體通透性更好的封口膠代替紗布或棉塞, 以及增加搖床振蕩速率也可獲得相同的效應(yīng)。
但需特別注意的是提高振蕩速率時(shí)必須注意燒瓶的放置位置與重力平衡，以減少由于角速度增加引起的磨耗和不平衡甚至翻車。如果使用棉塞和紗布時(shí)應(yīng)采用普通棉紗而非脫脂棉紗，以防吸水潮濕而妨礙氧的擴(kuò)散。
將經(jīng)接種的燒瓶固定到搖床上培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中應(yīng)特別注意兩個(gè)問題：一是上文已提及的溫度控制，另一個(gè)十分重要的問題就是維持連續(xù)振蕩。
振蕩不連續(xù)進(jìn)行那怕只是數(shù)分鐘的停頓，對(duì)結(jié)果的影響都是極顯著的；而且由于數(shù)分鐘的停頓對(duì)微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的影響不明顯，使影響從表面上不易被發(fā)現(xiàn)。有報(bào)道在用黑曲霉素生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵試驗(yàn)中，提高通氣率可以刺激檸檬酸的生產(chǎn)，中斷通氣時(shí)檸檬酸的產(chǎn)生直線下降，甚至不可逆轉(zhuǎn)。在繁殖期中斷通氣 20 min 不會(huì)使菌株的活力下降，但菌株生產(chǎn)和積累檸檬酸的能力受到不可逆的破壞或減慢。
經(jīng) 24～48 h 培養(yǎng)，可對(duì)燒瓶進(jìn)行檢查，以判斷生長(zhǎng)的程度和類型。在好氧生長(zhǎng)時(shí)，消耗1g葡萄糖通常可增加0.25～0.5g的細(xì)胞。單細(xì)胞性細(xì)菌經(jīng)培養(yǎng)后會(huì)出現(xiàn)一稠密或輕度稠密的培養(yǎng)物；而絲狀菌株如在含 5% 的糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)可形成密細(xì)胞培養(yǎng)物，4～5 天后, 細(xì)胞密度可達(dá)20～30g/L，如果培養(yǎng)物產(chǎn)生毒性物質(zhì)或大量的副產(chǎn)物以及產(chǎn)生抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的產(chǎn)物，則其生長(zhǎng)速度相應(yīng)降低。
振蕩培養(yǎng)過程中，必須定期定時(shí)分析培養(yǎng)過程中的各種參數(shù)。通過光密度、培養(yǎng)基中細(xì)胞沉積或通過過濾、干燥和稱重可定量或半定量地估計(jì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。迅速而粗略地估計(jì)細(xì)胞生長(zhǎng)的方法是將一些培養(yǎng)物放置于一小的測(cè)量瓶中，室溫靜置一段時(shí)間后根據(jù)細(xì)胞沉積粗略估計(jì)微生物細(xì)胞生長(zhǎng)情況。此外，培養(yǎng)液的 pH、殘?zhí)恰⑸|(zhì)、表觀和氣味的變化也應(yīng)隨時(shí)加以記錄；用顯微鏡檢測(cè)菌絲末端狀態(tài)、分枝情況、絮凝體形成及污染情況，對(duì)于掌握培養(yǎng)物的培養(yǎng)狀況也是重要的。
細(xì)胞或孢子接種濃度對(duì)試驗(yàn)的成功極為重要，不同的微生物細(xì)胞或孢子以及不同的振蕩培養(yǎng)過程的接種濃度差異可以是十分顯著的, 且各自存在一最適濃度。此必須在預(yù)試驗(yàn)中確定。最適接種濃度的獲得和使用可保證良好的生長(zhǎng)和高質(zhì)量的培養(yǎng)物的獲得。使用不同的接種濃度還可獲得不同的生產(chǎn)類型。例如，當(dāng)使用 2×102～1×103/ml 青霉孢子接種濃度時(shí)，經(jīng) 25℃ 培養(yǎng) 120 h 后菌絲呈平滑、致密沉積體；而當(dāng)接種濃度在 5×103～5×104/ml 時(shí)，相同條件下培養(yǎng)后則呈小、纖絲狀、絮凝物，直徑在 0.4 mm 左右。
振蕩培養(yǎng)中最常出現(xiàn)的另一問題是貧脊生長(zhǎng)。這通常是由于接種濃度太低或種子活力較差。經(jīng)驗(yàn)而言, 種子的培養(yǎng)時(shí)間為 1～2 天，接種后培養(yǎng)基中的孢子濃度在 5×104～1×106/ml。
振蕩培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)物被污染并不常見，但一旦被污染，會(huì)帶來許多麻煩。出現(xiàn)污染時(shí)，培養(yǎng)物表面為表觀改變，氣味異常，菌絲體霧濁不清，產(chǎn)品丟失等，需及時(shí)發(fā)現(xiàn)并及時(shí)處理。
Tip：方法僅供參考，操作中請(qǐng)按實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。