腎纖維化是慢性腎病（CKD）發(fā)展的核心病理特征之一，表現(xiàn)為腎間質(zhì)細胞外基質(zhì)（ECM）的異常沉積和成纖維細胞的持續(xù)激活，嚴重影響患者的腎功能和生活質(zhì)量。在眾多促纖維化因子中，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是公認的腎纖維化主要調(diào)控因子。因此，靶向TGF-β1及其下游分子一直被認為是抗CKD藥物開發(fā)的重要方向和策略。在長期的生活實踐中，大量的傳統(tǒng)草藥已被用于治療纖維化相關(guān)疾病，然而其有效成分及分子機制尚未被完全闡明。黃芫花(Wikstroemia chamaedaphne)因富含抗纖維化天然產(chǎn)物（NPs）被廣泛用于民間藥物治療水腫（腎臟相關(guān)疾病最突出的表現(xiàn)之一）。為此，中山大學第一附屬醫(yī)院研究團隊圍繞黃芫花展開研究，發(fā)現(xiàn)黃芫花粗提物（CE） 在減輕腎纖維化方面表現(xiàn)出顯著效果。進一步分離得到的化合物15（dapnepeduin A, DA）通過靶向Cdc42介導GSK-3β/β-catenin信號通路能夠減弱腎纖維化。從而揭示了DA作為一種天然來源的小分子抗纖維化藥物的巨大潛力，為腎纖維化的治療提供了新的分子靶點和策略。百泰派克生物科技憑借先進的腎臟組織分析技術(shù)，為解析腎臟疾病的分子機制、篩選潛在靶點以及評價藥物療效提供了有力支持。下面跟隨小編一起來看看這項研究吧~
1、DA作為腎成纖維細胞活化有效抑制劑的發(fā)現(xiàn)
研究觀察到黃芫花粗提物（CE）顯著減輕小鼠腎纖維化，如圖1A所示。在圖1B中，TGF‐β1穩(wěn)定誘導腎成纖維細胞中α‐SMA的表達和ECM的產(chǎn)生，而CE從5µg/mL開始導致這些纖維化指標的表達呈劑量依賴性下降，表明其抑制腎成纖維細胞的激活的有效活性。
為了進一步追蹤CE中的活性成分，研究人員對其進行了分離并分離出16種二萜（1-16），其中化合物15（dapnepeduin A，DA）的活性最強。在ECM方面，DA在候選化合物中對纖維連接蛋白和I型膠原的抑制效率也最為突出（圖1D）。同時，在MTS實驗中，DA對成纖維細胞呈低毒性，在10µM時細胞存活率為>90%。因此，考慮到療效和安全性，研究人員選擇DA作為有前景的先導物進行進一步的研究。該化合物以劑量和時間依賴性的方式降低了纖維化標志物的表達（圖1E，F(xiàn)）。
綜上所述，證明黃芫花的主要成分DA可以顯著抑制腎成纖維細胞的激活和ECM的產(chǎn)生。
圖1. 在TGF-β1激活的腎成纖維細胞中，DA作為一種有效的抗纖維化化合物
2、DA抑制腎小管細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化成纖維細胞的活化
活化的腎纖維細胞具有增強增殖和遷移能力，導致腎纖維化病變的產(chǎn)生。因此，研究人員接下來對DA在活化的腎纖維細胞中的作用進行了探究。通過對TGF-β1、血管緊張素II、白細胞介素17、脂多糖、白細胞介素-1β等誘導的腎纖維細胞中α-SMA和ECM表達進行研究發(fā)現(xiàn)，DA阻斷了α-SMA和ECM的表達且展現(xiàn)出對活化纖維細胞的增殖和遷移能力的抑制作用。同時，DA還被發(fā)現(xiàn)能夠抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的發(fā)生，恢復上皮標記物E-鈣黏蛋白的表達并降低基質(zhì)標記物（纖連蛋白和微絲蛋白）的表達。DA展現(xiàn)出顯著的抗纖維化活性。
圖2. DA阻斷腎成纖維細胞的活化和腎小管細胞的EMT
3、DA減輕UUO小鼠腎纖維化模型
為了評估DA在體內(nèi)的抗纖維化作用，研究采用了UUO小鼠模型，手術(shù)后7天給予低劑量（LD）和高劑量（HD） DA。與對照組相比，DA顯著下調(diào)了UUO小鼠腎臟中Acta2（編碼α‐SMA）、Col1a1、Col3a1（編碼膠原）和Fn1（編碼纖維連接蛋白）mRNA水平以及相應的蛋白質(zhì)水平（圖3A，B）。低劑量DA組在減少這些纖維化調(diào)節(jié)因子方面取得了與PFD組（陽性對照組）相似的效力。高劑量DA比PFD組表現(xiàn)出更好的效率，這支持了DA強大的抗腎纖維化活性。從血清肝酶（天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT））水平和體重下降可以看出，DA給藥并未誘導小鼠明顯的全身毒性（圖3D，E）。
將藥物分配到預定的部位對于提高療效和減少副作用至關(guān)重要，因此研究采用了廣泛使用的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC - MS/MS）方法來檢測不同器官中的含量。如圖3F所示，在腎臟和肝臟中，在色譜上都發(fā)現(xiàn)了DA的峰，并且DA在腎臟中似乎更富集；肺、心、脾均未見DA峰。
綜上所述，DA是一種有效的腎保護劑，可在體內(nèi)減輕小管間質(zhì)纖維化，具有較高的療效和安全性。
圖3. DA對UUO小鼠腎纖維化有保護作用
4、DA減少活化成纖維細胞中β-Catenin的積累
為了闡明DA抗纖維化作用的分子機制，研究進行了轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果顯示，兩組差異表達基因1593個，經(jīng)DA處理后基因上調(diào)1074個，下調(diào)519個（圖4A）。KEGG分析顯示，DA對Wnt信號通路發(fā)揮了顯著作用，而不是假定的促纖維化TGF-β/Smads信號通路（圖4B）。DA阻斷TGF-β1誘導的β-catenin上調(diào)（圖4C）。發(fā)現(xiàn)DA顯著抑制TGF-β1刺激的β-catenin細胞質(zhì)和細胞核積累，Wnt/β-catenin信號激活的主要特征以及纖維化基因轉(zhuǎn)錄（圖4D，E）。同時，在多個腎成纖維細胞和小管細胞模型中檢測到DA對各種刺激誘導的β-catenin水平的抑制作用。這些發(fā)現(xiàn)進一步支持了DA抑制β-catenin對抗腎纖維化。
圖4. DA促進了β-catenin在S33/37/45/T41位點的磷酸化，并促進β-catenin泛素化降解
DA增加了腎成纖維細胞中β-catenin (Ctnnb1) 的mRNA水平，因此假設(shè)DA介導的β-catenin的下調(diào)可能是由于蛋白質(zhì)降解。經(jīng)驗證，DA能促進β-catenin水解（圖4F）。此外，研究團隊還分析了DA對β-catenin泛素化修飾的影響，結(jié)果顯示DA處理可挽救TGF-β1還原的β-catenin泛素化（圖4G）。β-catenin的泛素化蛋白水解受到特定位點磷酸化狀態(tài)的嚴格控制，例如Ser33/37/45和Thr41位點，研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1顯著降低了β-catenin在Ser33/37/45/Thr41位點的磷酸化，這可以被DA拮抗從而促進β-catenin的降解（圖4H）。這些研究結(jié)果表明，DA通過上調(diào)β-catenin 在Ser33/37/45/Thr41殘基的磷酸化促進了β-catenin的泛素化蛋白水解。
這些觀察結(jié)果表明，DA的抗纖維化活性主要依賴于對促纖維化β-catenin信號通路的阻斷。
5、DA減輕UUO小鼠腎纖維化模型
為了驗證DA在體內(nèi)是否也靶向β-catenin信號傳導，研究團隊評估了用載體或DA處理的UUO小鼠腎臟中總β-catenin和磷酸化水平。與培養(yǎng)成纖維細胞的結(jié)果一致，DA以劑量依賴的方式降低了UUO腎臟中β-catenin的表達（圖5A）。同時，DA處理可以挽救UUO樣品中β-catenin促降解磷酸化Ser33/37/45/Thr41位點的減少，支持DA促進體內(nèi)β-catenin泛素化蛋白水解的假設(shè)（圖5B）。免疫組織化學染色顯示，在纖維化腎臟中β-catenin升高主要位于小管和小管間質(zhì)，可以通過給藥DA消除（圖5C）。高劑量DA使UUO腎臟恢復到接近健康小鼠的水平。
圖5. DA增加了UUO腎臟中p-β-catenin (S33/37/45/T41)，降低了總β-catenin含量
6、DA通過抑制Cdc42活性阻斷促纖維化β-Catenin信號傳導
研究采用熱蛋白組學策略進一步研究了DA阻斷纖維化促進的β-catenin信號通路的藥理機制。通過篩選確定了Cdc42可能是DA的靶標蛋白，并發(fā)現(xiàn)Cdc42在細胞質(zhì)中起著重要的信號轉(zhuǎn)導作用。隨后通過活性Cdc42 pull-down實驗、細胞熱轉(zhuǎn)移實驗、表面等離子共振（SPR）等驗證了這一結(jié)果。此外，利用分子對接和殘基突變實驗發(fā)現(xiàn)Leu119和Lys128是DA與Cdc42結(jié)合的關(guān)鍵位點。這些發(fā)現(xiàn)進一步揭示了DA的藥理機制。
圖6. DA直接與Cdc42結(jié)合并抑制其活性
7、DA依賴Cdc42調(diào)控p-PKCζ/p-GSK-3β/β-catenin軸并發(fā)揮抗纖維化活性
使用小干擾 RNA 耗盡成纖維細胞中的Cdc42，此時DA對纖維化的抑制作用減弱；Cdc42過表達可持續(xù)促進腎成纖維細胞的活化并阻斷了DA的抗纖維化能力，表明DA的藥效靶點為Cdc42。已知Cdc42 缺失會促進 β-catenin降解，該過程由蛋白激酶Cζ (p-PKCζ )和糖原合酶激酶 3β (p-GSK-3β) 磷酸化減少介導。p-GSK-3β 的減少實際上對應于 GSK-3β 的增加，后者通過在 Ser33/37/Thr41 處磷酸化 β-catenin 引發(fā)蛋白水解。因此研究假設(shè)Cdc42通過調(diào)節(jié)p-PKCζ/p-GSK-3β/β-catenin軸來調(diào)節(jié)腎成纖維細胞活化。驗證的結(jié)果與假設(shè)結(jié)果一致。
圖7. DA通過靶向Cdc42激活了p-PCKζ/p-GSK-3β介導的S33/37/T41位點的β-catenin磷酸化
8、Cdc42表達升高與小鼠和人腎纖維化相關(guān)
為了揭示Cdc42與CKD患者腎纖維化的臨床相關(guān)性，研究查詢了公共基因表達譜，發(fā)現(xiàn)CKD患者的Cdc42轉(zhuǎn)錄水平遠高于健康供者（圖8B）。此外，Cdc42與纖維化基因Acta2、Col1a、Col3a1、Fn1的表達呈顯著正相關(guān)（圖8C）。CKD患者和健康對照者的腎臟標本免疫組化結(jié)果顯示，在健康腎臟中，Cdc42在小管和腎小球中少量表達，而在小管間質(zhì)室中幾乎檢測不到。相比之下，在CKD患者腎臟的小管、腎小球和間質(zhì)中檢測到Cdc42的顯著增加（圖8D），暗示Cdc42參與腎臟纖維化。綜上所述，這些結(jié)果表明Cdc42的高表達與腎纖維化密切相關(guān)，因此藥物抑制Cdc42可能有益于CKD患者。
圖8. Cdc42在UUO小鼠和CKD患者中均有較高的表達
研究結(jié)論：
DA是一種天然的小分子二萜，它從藥用植物黃芫花中分離出來，是一種高效的抗纖維化藥物，能夠阻斷腎成纖維細胞的激活，減輕小鼠模型中的腎纖維化，它比陽性對照吡非尼酮更有效。從機制上說，DA與Cdc42結(jié)合并抑制其活性，從而降低下游p-PKCζ和p-GSK-3β水平，導致p-β-catenin （Ser33/37/Thr41）上調(diào)，并通過泛素-蛋白酶體途徑對β-catenin進行蛋白降解。
在未來的腎纖維化研究與治療中，天然產(chǎn)物的深入挖掘與靶向Cdc42介導的GSK-3β/β-連環(huán)蛋白信號通路的精準調(diào)控將為慢性腎病（CKD）的防治帶來新的希望。百泰派克生物科技作為生物質(zhì)譜領(lǐng)域的先行者，擁有專業(yè)的技術(shù)團隊和7大質(zhì)量控制檢測平臺，采用ISO9001認證質(zhì)量控制體系管理實驗室，獲國家CNAS實驗室認可，我們能夠?qū)崿F(xiàn)對腎臟組織的高分辨率解析，精確揭示不同細胞群體在腎纖維化過程中的動態(tài)變化和信號通路調(diào)控機制。我們誠摯邀請各界科研伙伴與我們攜手合作，共同揭示腎纖維化的深層機制，探索更具針對性和有效性的治療策略，為全球腎臟疾病患者帶來福音。
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參考文獻：
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