實驗室 & 工藝研發(fā)用切向流過濾技術(shù)簡介
簡介
切向流過濾（TFF）是對生物分子進行快速、高效分離和純化的技術(shù)，可廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)及微生物學(xué)等生物學(xué)領(lǐng)域。TFF可對10ml至數(shù)千升體積的樣品進行濃縮和脫鹽，也可以用于不同規(guī)格物質(zhì)的分離、收獲細胞懸液、澄清發(fā)酵液或細胞裂解液。本文將簡單介紹TFF的基本原理及其在實驗室和工藝研發(fā)中的應(yīng)用。
什么是切向流過濾？
膜過濾是生命科學(xué)實驗室廣泛使用的分離技術(shù)，根據(jù)膜的孔徑，可以分為微濾和超濾。微濾膜孔徑一般在0.1μm-10μm之間，常用于澄清、除菌、微粒的去除以及細胞收獲。超濾膜的孔徑一般在0.001-0.1μm之間，常用于可溶性分子（包括蛋白質(zhì)、多肽、核酸、碳水化合物及其它生物分子）的脫鹽和濃縮、緩沖液置換以及分餾操作，超濾膜的規(guī)格一般采用截留分子量（MWCO）來標(biāo)稱。
微濾和超濾都有兩種主要的過濾模式：1）直流過濾（DFF），也稱為“死端”過濾，進樣液流垂直于膜表面，液體100%穿過膜；2）切向流過濾（TFF），也稱為錯流過濾，進樣液流平行于膜表面，部分料液穿過膜（濾液），其余料液（回流液）循環(huán)回到進樣容器。在DFF中，隨著過濾的進行，大分子逐漸聚積在膜表面，并堵塞膜孔，降低過濾通量，即使增加壓力，也只能將聚積層壓緊，而不能改善過濾狀態(tài)。在TFF中，沿膜表面流動的料液會將膜表面由于濃差極化而形成的凝膠層“掃掠”清除，從而維持膜的過濾狀態(tài)，保證小分子通過。所以，相比DFF，TFF更加快速、高效。
直流過濾過程中，進樣液流直接穿過膜，比膜孔大的分子聚積在膜表面，形成凝膠，阻礙液流通過。隨著過濾體積的增加，凝膠層逐漸增厚，流速迅速降低。
切向流過濾過程中，樣品溶液從進樣通道進入，沿膜表面流動通過。切向流模式可防止分子在膜表面聚積而造成堵塞，從而減緩過濾流速的衰減，顯著提高單位膜表面積的樣品處理量。
為什么要使用切向流過濾？
1.TFF設(shè)置、使用簡單——通過軟管和接頭將TFF裝置簡單地連接到泵及壓力監(jiān)測設(shè)備，再將樣品加載到容器，即可進行操作。
2.TFF快速、高效——相比透析，TFF設(shè)置更加簡單，也更快速；而與離心相比，TFF可在更短的時間內(nèi)達到更高的樣品濃度。
3.可在單個系統(tǒng)內(nèi)實現(xiàn)兩步操作——可在同一個系統(tǒng)內(nèi)對樣品進行濃縮和洗濾，既節(jié)省時間，也可避免樣品損耗。
4.TFF可規(guī)模放大或縮小——TFF裝置和流路構(gòu)建可根據(jù)需要進行規(guī)模調(diào)整，處理樣品體積低可至10ml，高可達數(shù)千升。
5.TFF非常經(jīng)濟——TFF裝置和流路可清洗再生并重復(fù)使用，只需進行簡單的完整性測試，并確認組件及密封完好。也可單次使用后作拋棄型處理。
切向流過濾能做什么？
1.蛋白質(zhì)和多肽濃縮、脫鹽
2.核酸（DNA/RNA/核苷酸）濃縮、脫鹽
3.從細胞培養(yǎng)液中回收、純化抗體或重組蛋白
4.從細胞裂解液中回收、純化質(zhì)粒DNA或從全血中回收染色體DNA
5.分餾稀釋蛋白質(zhì)混合液
6.細胞裂解液或組織勻漿凈化
7.水、緩沖液及注射劑除熱源（去除內(nèi)毒素）
8.柱層析樣品制備
9.細胞收獲
10.病毒回收或去除
應(yīng)用
TFF的主要應(yīng)用包括濃縮、洗濾（脫鹽和換液）以及不同規(guī)格生物分子的分餾。此外，TFF也可用于發(fā)酵液、細胞培養(yǎng)液的澄清。
濃縮
濃縮是指從溶液中去除溶劑而保留溶質(zhì)分子的簡單過程。溶質(zhì)濃縮的程度與溶液體積的降低呈正比，如體積降低一半，濃度即增加一倍。
進行樣品濃縮時，所選超濾膜的MWCO需極低于目標(biāo)截留分子的分子量，這樣才能保證目標(biāo)分子的完整截留和高度回收。一般情況下，膜的MWCO可以選擇為目標(biāo)截留分子分子量的1/3-1/6。如果過濾通量或處理時間是主要考慮的因素，那么可選擇MWCO為目標(biāo)截留分子分子量1/3的膜，以獲得更高的流速；如果需要獲得較高的收率，則可以選擇MWCO為目標(biāo)截留分子分子量1/6的膜。
過濾器與系統(tǒng)安裝完備后，即可運行系統(tǒng)。推薦先用純水沖洗系統(tǒng)，并測試過濾器的水通量和完整性。添加待處理料液，進行錯流進樣，監(jiān)測進樣和回流壓力，收集回流液（或濾液）即可。當(dāng)達到所需的濃度后，停止運行，回收樣品或開始洗濾。
洗濾
洗濾實際上是一個分餾過程，小分子通過膜被漂洗掉，而大分子被截留在回流液中且不改變其終濃度。洗濾操作可用于清除鹽離子或進行緩沖液置換，也可以用于清除乙醇或其它小分子溶劑或添加劑。
洗濾可以按不同的模式進行。在連續(xù)型洗濾中，洗濾溶液（純水或緩沖液）連續(xù)補加到進樣容器，其速率與濾液流出的速率相同。在這種模式中，進樣容器中樣品的體積保持恒定，而小分子（如鹽離子）可自由滲透通過膜而被去除。比如在脫鹽過程中，每添加1體積的洗濾溶液（1體積為洗濾溶液未添加時的樣品的體積），鹽離子濃度約可降低一半。在連續(xù)型洗濾中，添加5體積洗濾溶液，離子強度一般可降低約99%。
而在間斷型洗濾中，溶液先稀釋，然后再濃縮回到起始體積，重復(fù)操作，直到容器內(nèi)小分子的濃度降低到要求的濃度。每添加1體積洗濾溶液（1體積為添加稀釋溶液前的樣品體積），鹽離子濃度約可降低一半。在間斷型洗濾中，添加5體積洗濾溶液，離子強度一般可降低約96%。
相比而言，連續(xù)型洗濾可以較少的洗濾體積達到更好的脫鹽效果。
洗濾前對樣品進行濃縮可顯著降低洗濾溶液的用量。比如通過間斷型洗濾將1L樣品的離子強度降低96%，約需要5L的洗濾溶液。如果先將樣品濃縮10倍，體積降低為100mL，則僅需500mL洗濾溶液即可完成洗濾操作，可顯著節(jié)省洗濾溶液和時間。但濃縮可能會增加樣品的粘度，從而降低過濾流速，操作前可進行預(yù)實驗，以達到最佳處理效果。
切向流過濾工藝參數(shù)
所有的切向流過濾設(shè)備的操作都涉及到2個重要的參數(shù)：跨膜壓（TMP）和錯流速率（CF）。
1.跨膜壓是使液體及滲透性分子穿過膜的驅(qū)動力。
2.錯流速率是溶液進入進樣通道并通過膜的速率，是對膜表面的聚積層進行“清掃”及濾液流速控制的重要參數(shù)。
樣品從進樣容器泵入進樣端口，穿過膜表面（錯流），從回流端口流出，回到進樣容器。液流可清掃掉截留在膜表面的大分子和聚積物，抑制濃差極化（在膜表面形成的濃縮生物分子層，可堵塞膜孔，造成膜污染）。液體流動通過狹窄的進樣通道，在進樣和回流端口之間形成壓力降。增加錯流速率或限制回流端口的軟管，可提高此壓力。跨膜壓是驅(qū)動液體穿過膜的動力。
流動通過膜的液體（即濾液或滲透液）可帶走比膜孔小的分子。同時調(diào)節(jié)跨膜壓和錯流速率可抑制膜污染，提高TFF效率，以在更短的時間內(nèi)處理更多的料液。
切向流過濾裝置
切向流過濾系統(tǒng)一般包括中空纖維切向流過濾組件、蠕動泵、軟管、壓力傳感器及監(jiān)測系統(tǒng)、樣品容器以及相關(guān)連接配件。壓力傳感器一般安裝在進樣、回流及濾液端口。
不建議在無壓力監(jiān)測設(shè)備的情況下進行TFF操作，至少需在泵及TFF組件之間（即進樣端口）安裝壓力監(jiān)測設(shè)備。壓力是影響TFF工藝的重要參數(shù)。對壓力進行監(jiān)測和控制可得到更加穩(wěn)定的處理結(jié)果，對于系統(tǒng)故障的排除以及工藝的優(yōu)化都至關(guān)重要。
切向流系統(tǒng)操作步驟
1.使用前用純水浸潤并預(yù)沖洗中空纖維膜組件，以去除甘油等保護劑。
2.測試膜組件的正常水通量（NWP），作為膜組件性能的基線參考（非必須步驟，如組件重復(fù)使用，建議進行測試）。
3.用樣品緩沖液潤濕并調(diào)適系統(tǒng)（對系統(tǒng)進行潤濕調(diào)適可去除系統(tǒng)內(nèi)的氣泡，調(diào)整系統(tǒng)溫度，并防止因與非緩沖液溶液接觸而可能導(dǎo)致的生物分子的沉淀或變性）。
4.樣品處理（濃縮、洗濾或分餾）。
5.清洗，確認清洗效果。
6.儲存TFF組件。
怎樣選擇合適的TFF系統(tǒng)
要根據(jù)應(yīng)用選擇合適的TFF系統(tǒng)，可按以下步驟進行：
第一步：明確TFF工藝的目的
我們將樣品中的目標(biāo)生物分子稱為產(chǎn)物。選擇的分離膜可以是截留產(chǎn)物而去除不需要的低分子量污染物，或者允許產(chǎn)物通過而截留樣品的高分子量成分。此外，也可以將兩種方式相結(jié)合，進行兩步操作，分別分離開較高及較低分子量的成分。在第一階段，選擇的膜允許產(chǎn)物通過而截留高分子量成分，然后將第一階段收集的濾液作為樣品，進行第二階段的處理，此時選擇可濃縮產(chǎn)物而去除低分子量物質(zhì)的膜。
操作前，必需先明確分離目的——濃縮、洗濾或分餾。同時，也需要考慮待處理樣品的體積，以及可能的規(guī)模放大需求。此外，明確工藝最終要求的濃縮因子及脫鹽程度，也是選擇合適的膜及系統(tǒng)的關(guān)鍵。
第二步：選擇合適的膜截留分子量
膜的截留分子量（MWCO）通常定義為溶液中截留率為90%的分子的分子量。如前所示，需要截留產(chǎn)物時，所選膜的MWCO需為目標(biāo)蛋白分子量的1/3-1/6。而進行分餾操作時，所選膜的MWCO需低于待截留分子的分子量，且高于需去除分子的分子量。
第三步：選擇流道規(guī)格
樣品的濃度和溶液的狀態(tài)（粘度、顆粒度等）是流道選擇的決定性因素。中空纖維膜過濾器是典型的開放式流道，常規(guī)的流道高度為0.5或1.0mm，在進行細胞收獲時，這種結(jié)構(gòu)可避免細胞破壞，并使?jié)饪s后完整細胞的收率最大化。在處理高粘度（如血清）或高顆粒含量料液時，也可以達到較為出色的性能。而具有湍流增強型或次流道加強型流道的過濾器通常適合處理較為澄清或已預(yù)過濾的料液。
第4步：確定所需的膜表面積
選擇合適的過濾器膜表面積取決于待處理料液的體積、預(yù)期的處理時間以及要求的終產(chǎn)物體積。
可以根據(jù)以下公式計算所需的過濾器膜表面積：