小鼠生長分化因子 15 ELISA 試劑盒
產(chǎn)品編號：SEKM-0086
適用于小鼠血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液等樣本
背景介紹：
? ? ? 生長分化因子-15(GDF-15)，又稱巨噬細(xì)胞抑制因子-1(MC-1)，胎盤轉(zhuǎn)化生長因子-β，前列腺衍生因子，非甾體抗炎藥物激活基因，胎盤骨形成蛋白，是轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族的不同成員，是一種40 kda不活躍的前體蛋白，被蛋白裂解釋放活性的C-末端片段，并以活性二硫鍵連接的同源二聚體的形式分泌到循環(huán)中。在正常情況下，GDF-15在胎盤中高表達(dá)，在腎臟、肝臟、肺、胰腺和前列腺等多種組織中表達(dá)量較低，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)上皮中也有表達(dá)，活化的巨噬細(xì)胞表達(dá)是由炎癥細(xì)胞因子IL-1β和TGF-β誘導(dǎo)的，GDF-15具有多種生物學(xué)功能，在炎癥、癌癥和炎癥中起著重要的作用。GDF-15在動脈粥樣硬化或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等炎癥狀態(tài)下升高，GDF-15在許多癌癥中表達(dá)增加，GDF-15的代謝效應(yīng)與調(diào)節(jié)食欲和能量穩(wěn)態(tài)的神經(jīng)元通路有關(guān)。晚期癌癥或慢性疾病與小鼠和人類的厭食/惡病質(zhì)有關(guān)，GDF-15也發(fā)揮了心臟保護(hù)作用，在小鼠模型中，GDF-15的誘導(dǎo)可保護(hù)心臟免受缺血/再灌注損傷，GDF-15的過度表達(dá)可減輕心室擴(kuò)張和心力衰竭，在人類中，血清GDF-15濃度與急性冠狀動脈綜合征的風(fēng)險(xiǎn)及其預(yù)后有關(guān)。?
? ? ? 生長分化因子-15(GDF-15)，又稱巨噬細(xì)胞抑制因子-1(MC-1)，胎盤轉(zhuǎn)化生長因子-β，前列腺衍生因子，非甾體抗炎藥物激活基因，胎盤骨形成蛋白，是轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族的不同成員，是一種40 kda不活躍的前體蛋白，被蛋白裂解釋放活性的C-末端片段，并以活性二硫鍵連接的同源二聚體的形式分泌到循環(huán)中。在正常情況下，GDF-15在胎盤中高表達(dá)，在腎臟、肝臟、肺、胰腺和前列腺等多種組織中表達(dá)量較低，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)上皮中也有表達(dá)，活化的巨噬細(xì)胞表達(dá)是由炎癥細(xì)胞因子IL-1β和TGF-β誘導(dǎo)的，GDF-15具有多種生物學(xué)功能，在炎癥、癌癥和炎癥中起著重要的作用。GDF-15在動脈粥樣硬化或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等炎癥狀態(tài)下升高，GDF-15在許多癌癥中表達(dá)增加，GDF-15的代謝效應(yīng)與調(diào)節(jié)食欲和能量穩(wěn)態(tài)的神經(jīng)元通路有關(guān)。晚期癌癥或慢性疾病與小鼠和人類的厭食/惡病質(zhì)有關(guān)，GDF-15也發(fā)揮了心臟保護(hù)作用，在小鼠模型中，GDF-15的誘導(dǎo)可保護(hù)心臟免受缺血/再灌注損傷，GDF-15的過度表達(dá)可減輕心室擴(kuò)張和心力衰竭，在人類中，血清GDF-15濃度與急性冠狀動脈綜合征的風(fēng)險(xiǎn)及其預(yù)后有關(guān)。?
檢測原理：
? ? ? Solarbio ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。將抗小鼠GDF-15 單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上；分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)稀釋的樣本，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠GDF-15 會與酶標(biāo)板上的包被抗體充分結(jié)合；洗板后加入生物素化抗小鼠 GDF-15 抗體，該抗體會與板子上包被抗體捕獲的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠 GDF-15 發(fā)生特異性結(jié)合；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發(fā)生高強(qiáng)度的非共價(jià)結(jié)合；洗板后加入顯色劑底物 TMB，若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的小鼠 GDF-15 ，則 HRP 會使無色 TMB 變成不同深淺（正相關(guān)）的藍(lán)色物質(zhì)，加入終止液后反應(yīng)孔會變成黃色；最后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應(yīng)孔樣品吸光度（OD），樣本中的小鼠濃度與 OD 成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計(jì)算出樣本中小鼠的濃度。
原理圖：
注意事項(xiàng)：
1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時(shí)應(yīng)保存在 2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請?jiān)谑覝鼗謴?fù) 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測，且加入試劑的順序應(yīng)保持一致。
5. 為避免交叉污染，請?jiān)谠囼?yàn)中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。
? ? ? Solarbio ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。將抗小鼠GDF-15 單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上；分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)稀釋的樣本，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠GDF-15 會與酶標(biāo)板上的包被抗體充分結(jié)合；洗板后加入生物素化抗小鼠 GDF-15 抗體，該抗體會與板子上包被抗體捕獲的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠 GDF-15 發(fā)生特異性結(jié)合；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發(fā)生高強(qiáng)度的非共價(jià)結(jié)合；洗板后加入顯色劑底物 TMB，若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的小鼠 GDF-15 ，則 HRP 會使無色 TMB 變成不同深淺（正相關(guān)）的藍(lán)色物質(zhì)，加入終止液后反應(yīng)孔會變成黃色；最后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應(yīng)孔樣品吸光度（OD），樣本中的小鼠濃度與 OD 成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計(jì)算出樣本中小鼠的濃度。
原理圖：
注意事項(xiàng)：
1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時(shí)應(yīng)保存在 2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請?jiān)谑覝鼗謴?fù) 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測，且加入試劑的順序應(yīng)保持一致。
5. 為避免交叉污染，請?jiān)谠囼?yàn)中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。
6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運(yùn)輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時(shí)，請用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確，每次檢測均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作小鼠員在使用時(shí)請帶上手套并注意防護(hù)；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時(shí)，請按國家生物實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。
試劑盒組成及儲存：
自備實(shí)驗(yàn)器材（不提供，可代購）
1． 酶標(biāo)儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機(jī)或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管
樣本收集及儲存：
1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：
將細(xì)胞培養(yǎng)基移至無菌離心管，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時(shí)內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時(shí)內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請?jiān)俅坞x心，避免反復(fù)凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時(shí)內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標(biāo)物檢測濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的最高值，請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實(shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù)。
試劑準(zhǔn)備：
1. 試劑回溫：首先在實(shí)驗(yàn)前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預(yù)先計(jì)算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）1000?L至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其完全溶解后輕輕混勻(濃度為1000pg/ml)，按照以下濃度進(jìn)行2倍稀釋： 250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9、0pg/ml進(jìn)行稀釋。250pg/ml作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高點(diǎn)濃度，標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零點(diǎn)（0pg/ml）。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液（1000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。
4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計(jì)算好試驗(yàn)所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請?jiān)?0分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。
5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗(yàn)所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請?jiān)?0分鐘內(nèi)使用。
6. 洗滌方法：
? 自動洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔,注與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。
? 手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止30 秒后甩凈酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。
檢測步驟：
結(jié)果判斷：
1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長檢測，請用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。
2.計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均 OD 值：每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值
3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中GDF-15含量可通過對應(yīng)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。
4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測，計(jì)算濃度時(shí)再乘以稀釋倍數(shù)。
參數(shù)表征：
1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線
本圖僅供參考，應(yīng)以當(dāng)次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠 GDF-15 的樣本含量。
2. 靈敏度：
最低可檢測小鼠 GDF-15 濃度達(dá) 2pg/ml，
20 個零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算相應(yīng)的可檢測濃度。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確，每次檢測均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作小鼠員在使用時(shí)請帶上手套并注意防護(hù)；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時(shí)，請按國家生物實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。
試劑盒組成及儲存：
自備實(shí)驗(yàn)器材（不提供，可代購）
1． 酶標(biāo)儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機(jī)或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管
樣本收集及儲存：
1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：
將細(xì)胞培養(yǎng)基移至無菌離心管，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時(shí)內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時(shí)內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請?jiān)俅坞x心，避免反復(fù)凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時(shí)內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標(biāo)物檢測濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的最高值，請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實(shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù)。
試劑準(zhǔn)備：
1. 試劑回溫：首先在實(shí)驗(yàn)前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預(yù)先計(jì)算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）1000?L至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其完全溶解后輕輕混勻(濃度為1000pg/ml)，按照以下濃度進(jìn)行2倍稀釋： 250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9、0pg/ml進(jìn)行稀釋。250pg/ml作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高點(diǎn)濃度，標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零點(diǎn)（0pg/ml）。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液（1000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。
4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計(jì)算好試驗(yàn)所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請?jiān)?0分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。
5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗(yàn)所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請?jiān)?0分鐘內(nèi)使用。
6. 洗滌方法：
? 自動洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔,注與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。
? 手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止30 秒后甩凈酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。
檢測步驟：
結(jié)果判斷：
1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長檢測，請用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。
2.計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均 OD 值：每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值
3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中GDF-15含量可通過對應(yīng)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。
4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測，計(jì)算濃度時(shí)再乘以稀釋倍數(shù)。
參數(shù)表征：
1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線
本圖僅供參考，應(yīng)以當(dāng)次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠 GDF-15 的樣本含量。
2. 靈敏度：
最低可檢測小鼠 GDF-15 濃度達(dá) 2pg/ml，
20 個零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算相應(yīng)的可檢測濃度。
3. 特異性：?
不與小鼠 GDF-1、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-15 人的 GDF-11 等反應(yīng)。
4. 重復(fù)性：
板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%。
5. 回收率：
在選取的健康小鼠血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的小鼠 GDF-15 ，計(jì)算回收率。
6. 線性稀釋：
分別在選取的 4 份健康小鼠血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 GDF-15 ，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評估線性。
常見問題及解決方法：
