使用CESI-MS技術(shù)分離檢測(cè)單克隆抗體的蛋白亞型以及抗體的純度-商家動(dòng)態(tài)-資訊-生物在線(xiàn)

使用CESI-MS技術(shù)分離檢測(cè)單克隆抗體的蛋白亞型以及抗體的純度

引言

免疫球蛋白（IgGs）是制備治療性單克隆抗體（mAbs）過(guò)程中最常見(jiàn)的分子。運(yùn)用高靈敏度的檢測(cè)手段全面研究這些分子的性質(zhì)，對(duì)于抗體藥物的開(kāi)發(fā)、藥效控制、生物利用度以及安全性而言是必不可少的。近幾十年來(lái)，對(duì)于完整的單克隆抗體以及還原的單克隆抗體的分析已成為生物制藥產(chǎn)業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，并且這些研究工作逐漸向CESI?平臺(tái)延伸。我們利用CESI-MS技術(shù)在一次分析過(guò)程中，同時(shí)獲得完整或者還原的單克隆抗體的電荷異質(zhì)性、純度以及分子量等信息。分析結(jié)果與CE-SDS以及毛細(xì)管等點(diǎn)聚焦（cIEF）的分析結(jié)果是相吻合。CE-SDS和cIEF是目前工業(yè)中認(rèn)可的兩種分析單克隆抗體藥物的方法。

CE和MS分別是單克隆抗體的電荷異質(zhì)性、純度以及分子量表征的重要方法。而將CE與MS結(jié)合起來(lái)，我們就可以將單克隆抗體的電荷異質(zhì)性、純度以及分子量等幾種表征結(jié)合到一次分析中來(lái)完成。此外，高分辨的質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)可以幫助我們鑒定未知的CE峰。相對(duì)于光學(xué)檢測(cè)，也可以獲得更為準(zhǔn)確的純度信息和分子量信息。

CESI技術(shù)是將CE與電噴霧整合在一個(gè)過(guò)程當(dāng)中，同時(shí)也降低了質(zhì)譜分析對(duì)樣品的要求。在這部分工作中，我們使用CESI-MS技術(shù)同時(shí)測(cè)定了單克隆抗體的電荷異質(zhì)性、純度以及分子量等信息。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，我們使用CESI-MS技術(shù)以及其他基于CE的技術(shù)對(duì)完整的和還原的IgG1，IgG2以及IgG4進(jìn)行了分析。

CESI-MS技術(shù)分析單克隆抗體的電荷異質(zhì)性采用的是CZE的模式，結(jié)果和采用cIEF方法的結(jié)果是一致的1-3。蛋白的翻譯后修飾，例如糖基化修飾引起電荷異質(zhì)性，這些異構(gòu)體在電泳中的遷移時(shí)間有所不同。電荷異質(zhì)性分離中的另外一些峰也可能是樣品中存在的雜質(zhì)。此外，在基于CZE測(cè)定單克隆抗體電荷異質(zhì)性的實(shí)驗(yàn)中使用質(zhì)譜作為檢測(cè)器的優(yōu)勢(shì)在于：可以同時(shí)獲得分子量以及樣品的純度的信息。

CESI 8000 Triple TOF? 6600聯(lián)用。使用的離子源型號(hào)是Nanospray III，毛細(xì)管是中性涂層毛細(xì)管。

實(shí)驗(yàn)材料和方法

樣品制備：在CESI-MS技術(shù)的實(shí)驗(yàn)中，IgG1，IgG2以及IgG4的溶液（濃度為20 mg/mL）使用脫鹽柱（Thermo Fisher Scientific）脫鹽，然后溶解在50mM（pH 4）的醋酸銨溶液中。IgG的還原是向IgG的溶液中加入10 mM的二硫蘇糖醇和0.1%的Rapigest SF表面活性劑（Waters），然后在60 ℃下恒溫45分鐘。加入0.5 %的甲酸，37 ℃恒溫10分鐘，將Rapigest切斷，隨后加入沉淀劑將Rapigest去除。然后向溶液中加入高濃度（2 M，pH 4）的醋酸銨使其終濃度為50 mM。單獨(dú)使用CE時(shí)，IgG分子被溶解在兩性電解質(zhì)的溶液中（cIEF）或者SDS的凝膠溶液中（CE-SDS）。在SDS凝膠溶液中的還原反應(yīng)是在60 ℃下進(jìn)行的，加入10 mM二硫蘇糖醇，恒溫10分鐘。

CESI 8000單獨(dú)進(jìn)行毛細(xì)管電泳時(shí)的條件：CE-SDS和cIEF的實(shí)驗(yàn)使用的SCIEX PA 800 Plus的試劑盒和操作流程。

CESI 8000與質(zhì)譜聯(lián)用時(shí)的條件：CESI的實(shí)驗(yàn)使用的儀器是SCIEX CESI 8000 Plus系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有控溫的自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，最大電壓為30 kV的高壓系統(tǒng)。使用的毛細(xì)管是中性涂層毛細(xì)管，毛細(xì)管的尖端經(jīng)過(guò)腐蝕形成一個(gè)電噴霧的噴口。分離過(guò)程中的緩沖溶液和導(dǎo)電溶液是3%的醋酸。進(jìn)樣壓力為5 psi，進(jìn)樣時(shí)間為10 s，進(jìn)入毛細(xì)管的樣品體積約為7.5 nL。由于樣品是溶解在50 mM的醋酸銨中，因此在進(jìn)樣之后會(huì)有一個(gè)瞬態(tài)的等速電泳過(guò)程將樣品進(jìn)行堆積。預(yù)分離過(guò)程中，分離條件為：電壓30 kV，壓力2psi，分離時(shí)間為7 min。然后將壓力增大到10 psi分離10 min，并進(jìn)行電噴霧。

質(zhì)譜條件：CESI 8000 與Triple TOF?6600聯(lián)用，使用的離子源型號(hào)是Nanospray III，連接CESI的適配器。完整蛋白的掃描范圍為400-4500 m/z。

數(shù)據(jù)處理：處理高分辨的質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用的軟件是SCIEX PeakView?和BioPharmaView?

結(jié)果與討論

CESI-MS技術(shù)對(duì)單克隆抗體的分析使用的是中性涂層的毛細(xì)管，分別測(cè)定了非還原以及還原的樣品。非還原的IgG1經(jīng)過(guò)CZE的分離（圖1），獲了它的電荷異質(zhì)性信息，同時(shí)也準(zhǔn)確地測(cè)定了不同異構(gòu)體的分子量，此外根據(jù)去卷積的結(jié)果也鑒定了樣品中的雜質(zhì)。我們檢測(cè)到了兩類(lèi)主要的的IgG1，含量高的一類(lèi)IgG1的平均分子量是146900 Da，另外一種酸化的IgG1的平均分子量為151005 Da。除了分子量的不同，它們的糖型也不相同。經(jīng)過(guò)對(duì)去卷積的結(jié)果進(jìn)一步處理，能夠促進(jìn)我們對(duì)氨基酸序列和糖型的測(cè)定。通過(guò)質(zhì)譜我們檢測(cè)到了另外兩種類(lèi)型的IgG1，它可能是樣品處理過(guò)程中產(chǎn)生的雜質(zhì)。IgG1的雜質(zhì)里包含了大量的分子量為28608、36687和46585的分子。雜質(zhì)中最大分子量為100545，與重鏈-重鏈二聚體的分子量和糖型是一致的。

圖1.使用質(zhì)譜對(duì)lgG1的電荷異質(zhì)性進(jìn)行檢測(cè)。圖為非還原型lgG1

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