淋巴細(xì)胞雜交瘤單克隆抗體技術(shù)
1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破不僅為醫(yī)學(xué)與生物學(xué)基礎(chǔ)研究開創(chuàng)了新紀(jì)元，也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具。
制備單克隆抗體包括動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過幾個(gè)月的一系列實(shí)驗(yàn)步驟，下面按照制備單克隆抗體的流程順序，逐一介紹其實(shí)驗(yàn)方法。
一、細(xì)胞融合前準(zhǔn)備
(一) 免疫方案
選擇合適的免疫方案對于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般要在融合前兩個(gè)月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。
1. 顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細(xì)胞性抗原為例的免疫方案:
初次免疫 1×10７／0.5ml ip (腹腔內(nèi)注射)
↓ 2～3周后
第二次免疫 1×10７／0.5ml ip
↓ 3周后
加強(qiáng)免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(靜脈內(nèi)注射)
↓
取脾融合
2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴(kuò)散呈小滴狀表明已達(dá)到油包水的狀態(tài)。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射
│ (一般0.8～1ml 0.2ml／點(diǎn))
↓3周后
第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip
│ (ip劑量不宜超過0.5ml)
↓3周后
第三次免疫 劑量同上，不加佐劑，ip
│ (5～7天后采血測其效價(jià)，檢測免疫效果)
↓2～3周后
加強(qiáng)免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv
↓3天后
取脾融合
目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆粒化或固相化，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，促進(jìn)免疫細(xì)胞對抗原反應(yīng)性。
(二) 飼養(yǎng)細(xì)胞
在制備單克隆抗體過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如：在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(較為常用)、小鼠脾臟細(xì)胞或小鼠胸腺細(xì)胞，也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞，使用比較方便，照射后可放入液氮罐長期保存，隨用隨復(fù)蘇。
小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備
小鼠采用與免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周齡
↓
拉頸處死 浸泡于75％酒精，消毒3～5分鐘
↓
用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜
↓
用無菌注射器注入6～8ml培養(yǎng)液
↓
反復(fù)沖洗，吸出沖洗液
↓
放入10ml離心管，1200轉(zhuǎn)／分離心5～6分鐘
↓
用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)1×10５／ml
↓
加入96孔板，100μl／孔
↓
放入37℃ CO2孵箱培養(yǎng)
一般飼養(yǎng)細(xì)胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得5～8×106腹腔巨噬細(xì)胞，若用小鼠胸腺細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞濃度為5×106／ml，小鼠脾細(xì)胞為1×106／ml，小鼠的成纖維細(xì)胞(3T3)1×105／ml，均為100μl／孔。
(三) 骨髓瘤細(xì)胞
骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細(xì)胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量 McAb。
常用骨髓瘤細(xì)胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。
骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10～20％，細(xì)胞的最大密度不得超10６／ml，一般擴(kuò)大培養(yǎng)以1∶10稀釋傳代，每3～5天傳代一次。細(xì)胞的倍增時(shí)間為16～20小時(shí)，上述三株骨髓瘤細(xì)胞系均為懸浮或輕微貼壁生長，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細(xì)胞。
一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞，為確保該細(xì)胞對HAT的敏感性，每3～6月應(yīng)用8～AG(8氮雜鳥嘌呤)篩選一次，以防止細(xì)胞的突變。
保證骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期，良好的形態(tài)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95％，也是決定細(xì)胞融合的關(guān)鍵。
(四) 免疫脾細(xì)胞
免疫脾細(xì)胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細(xì)胞棗漿母細(xì)胞。一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，由于此時(shí)B淋巴母細(xì)胞比例較大，融合的成功率較高。
脾細(xì)胞懸液的制備：在無菌條件下取出脾臟，用不完全的培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的２倍，細(xì)胞數(shù)為２×10８左右。
二、細(xì)胞融合，選擇雜交瘤
(一) 細(xì)胞融合流程
(1) 取對數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞SP2／0，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。
(2) 同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。
(3) 將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘。
(4) 棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。
(5) 輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)。
(6) 在室溫下融合:
① 30秒內(nèi)加入預(yù)熱的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，邊加邊攪拌。
② 作用90秒鐘，若冬天室溫較低時(shí)可延長至120秒鐘。
③ 加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔２分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
(7) 離心，800rpm，6分鐘。
(8) 棄上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開。
(9) 根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液，10ml一塊96孔板。
(10) 將融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)。
一般一塊96孔板含有1×107脾細(xì)胞。
(二) HAT選擇雜交瘤
應(yīng)用HAT 選擇培養(yǎng)液篩選雜交瘤細(xì)胞的原理已在研究生專題講座第六專題中已經(jīng)提到，這里主要介紹加HAT選擇培養(yǎng)的時(shí)間和濃度。
一般在融合24小時(shí)后，加HAT選擇培養(yǎng)液。HT和HAT均有商品化試劑50×貯存，用時(shí)1ml加入50ml20％小牛血清完全培養(yǎng)液中。
因?yàn)樵谂囵B(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細(xì)胞、融合后的細(xì)胞，200μl／孔。所以在加選擇培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)加3倍量的HAT。我們認(rèn)為，融合后最初補(bǔ)加的量可用全量的2／3進(jìn)行選擇，可得到滿意的篩選結(jié)果。
50×HAT
H: 5×10-3M
A: 2×10-5M
T: 8×10-4M
一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。
三、抗體的檢測
篩選雜交瘤細(xì)胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1／10面積時(shí)，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。
檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。
常用的方法有:
1. ELISA用于可溶性抗原(蛋白質(zhì))、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測。
2. RIA用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測。
3. FACS(熒光激活細(xì)胞分類儀)用于檢查細(xì)胞表面抗原的McAb檢測。
4. IFA用于細(xì)胞和病毒McAb的檢測。
上述方法均為一般實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法，故在此不介紹具體的實(shí)驗(yàn)過程。
可靠的篩選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當(dāng)貽誤整個(gè)篩選時(shí)機(jī)。
四、雜交瘤的克隆化和凍存
克隆化一般是指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。犚r為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞；所需要的抗體(特異性抗體)分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開，就需要克隆化。克隆化的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長速度比抗體分泌的細(xì)胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。
(一) 克隆化方案
用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。
1. 有限稀釋法的程序
① 制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液(同融合前準(zhǔn)備)
② 陽性孔細(xì)胞的計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞數(shù)在1～5×10３／ml
③ 取130個(gè)細(xì)胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細(xì)胞完全培養(yǎng)液，即20個(gè)細(xì)胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排為每孔2個(gè)細(xì)胞。余下2.9ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.9ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液,細(xì)胞數(shù)為10個(gè)／ml，100μl／孔加D、E、F三排，為每孔1個(gè)細(xì)胞。余下2.2ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.2ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)5個(gè)／ml，100μl／孔，加G、H兩排，為每孔0.5個(gè)細(xì)胞。
④ 培養(yǎng)4～5天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細(xì)胞克隆，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液200μl／孔。
⑤ 第8～9天時(shí)，肉眼可見細(xì)胞克隆，及時(shí)進(jìn)行抗體檢測。
注:初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在完全培養(yǎng)液中加HT。
2. 軟瓊脂法
① 軟瓊脂的配制
含20％FCS(小牛血清)的2倍濃縮的RPMI1640
1％瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預(yù)熱。
0.5％瓊脂：由1份1％瓊脂加1份含20％小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。
② 用上述0.5％瓊脂液(含有飼養(yǎng)細(xì)胞)15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。
③ 按100／ml，500／ml或5000／ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。
④ 1ml 0.5％瓊脂液(42℃預(yù)熱)