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? ? ? ?干細(xì)胞能夠分化成為機(jī)體內(nèi)任何類型的細(xì)胞，既是研究人體早期發(fā)育的理想工具，也是細(xì)胞治療的寶貴資源，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有非常廣泛的應(yīng)用。干細(xì)胞及其分化細(xì)胞的異質(zhì)性是干細(xì)胞的固有特性，如果我們使用一群細(xì)胞進(jìn)行測序就會掩蓋這種異質(zhì)性。而單細(xì)胞測序可以幫助我們挖掘這種異質(zhì)性，尋找細(xì)胞群體的變化及發(fā)生機(jī)制。
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圖1 干細(xì)胞發(fā)育以及分化研究
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從2016年十三五計劃開始后，在生物科研領(lǐng)域，干細(xì)胞的研究就作為一個重點課題受到科技部的特別支持，并作為首批進(jìn)入國家重點研發(fā)計劃的專項。2016年和2017年科技部發(fā)布的“干細(xì)胞及轉(zhuǎn)化研究”專項，每次支持項目40個左右，單個項目從500萬~3000萬不等，總經(jīng)費(fèi)支持達(dá)到數(shù)十億，主要聚焦在干細(xì)胞及轉(zhuǎn)化研究的重大基礎(chǔ)科學(xué)問題和瓶頸性關(guān)鍵技術(shù)，力爭取干細(xì)胞及轉(zhuǎn)化研究得科學(xué)理論和核心技術(shù)的原創(chuàng)突破，推動干細(xì)胞研究成果向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化，整體提升我國干細(xì)胞及轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究水平。
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總結(jié)近兩年的重點專項課題，干細(xì)胞及轉(zhuǎn)化的研究主要集中在以下幾個方向：①細(xì)胞重編程構(gòu)建多能干細(xì)胞；②組織干細(xì)胞的獲取及功能、調(diào)控；③干細(xì)胞定向分化及細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；④干細(xì)胞移植后體內(nèi)功能建立與調(diào)控；⑤基于干細(xì)胞的組織和器官功能再造；⑥干細(xì)胞資源庫；⑦利用動物模型的干細(xì)胞臨床前評估；⑧干細(xì)胞臨床研究。
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ChromiumTM Single Cell 3' Solution作為一個高通量的單細(xì)胞測序技術(shù)，全面剖析干細(xì)胞的異質(zhì)性，幫助鑒定不同表型的細(xì)胞，在干細(xì)胞領(lǐng)域有非常廣泛的應(yīng)用。目前該技術(shù)在干細(xì)胞領(lǐng)域的研究一共發(fā)表了多篇高水平的文章，聚焦的方向包含了多能干細(xì)胞、器官干細(xì)胞（腸道、淚腺）、間充質(zhì)干細(xì)胞的分化干細(xì)胞重編程過程以及自我更新機(jī)制等。小編做了匯總，供各位科研達(dá)人參考。
表1 ChromiumTM Single Cell 3’ Solution在干細(xì)胞領(lǐng)域發(fā)表文章匯總
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在干細(xì)胞領(lǐng)域發(fā)表的文章影響因子都很高，那么這些如此有影響力的文章都在研究什么？如何設(shè)計的課題呢？小編詳細(xì)解讀了2篇用ChromiumTM Single Cell 3’ Solution發(fā)表的研究干細(xì)胞的文章，繼續(xù)給科研達(dá)人們參考。
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Distinct Mesenchymal Lineages and Niches Promote EpithelialSelf-Renewaland Myofibrogenesisinthe Lung
期刊：《Cell》發(fā)表時間：2017.9 影響因子：28.71發(fā)表單位：美國賓夕法尼亞州費(fèi)城兒童醫(yī)院兒科心臟病科，賓夕法尼亞大學(xué)
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? 在成體肺組織中，上皮祖細(xì)胞從周圍的間質(zhì)細(xì)胞中獲得旁分泌信號，這些信號可以調(diào)節(jié)上皮祖細(xì)胞進(jìn)行增殖和分化。哺乳動物的肺組織包含大量的特定的上皮細(xì)胞，其被包圍在定義不明的異質(zhì)間充質(zhì)中。肺間質(zhì)隔室包括氣道平滑?。ˋSM），血管平滑?。╒SM），內(nèi)皮細(xì)胞和界限不清的間質(zhì)細(xì)胞。為了鑒定參與并提供信號以促進(jìn)肺泡自我更新和再生的細(xì)胞譜系，并表征特征基因，我們使用10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)整個肺間質(zhì)分選為五類基于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑讀出的不同細(xì)胞譜系。 ? ? 研究人員使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序和信號譜系記錄產(chǎn)生空間和轉(zhuǎn)錄肺間質(zhì)圖。發(fā)現(xiàn)每一個間充質(zhì)譜系具有明顯的空間位置和轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致獨特的利基（生態(tài)位）監(jiān)管職能。間質(zhì)性肺泡利基細(xì)胞Wnt信號響應(yīng)，表達(dá)血小板衍生生長因子受體，對于肺泡上皮細(xì)胞生長和自愈是至關(guān)重要的。 ? 2.1 流式分選5,572個小鼠肺間質(zhì)細(xì)胞使用ChromiumTM Single Cell 3’ Solution進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序：獲得每個細(xì)胞68k Reads數(shù)，中值基因1,017，每個細(xì)胞的平均UMI計數(shù)為2,040； ? 2.2 Axin2CreERT2：tdT和PdgfrɑCreERT2用于譜系追蹤。 ? ? 3.1 信號通路報告系統(tǒng)可以識別和鑒定不同的成年肺間質(zhì)譜系； 我們使用最近描述由我們實驗室合成的Axin2CreERT2連同Wnt2CreERT2和PdgfraEGFP這些示蹤信號，鑒定Wnt或Pdgfr信號活動和表達(dá)的間充質(zhì)細(xì)胞的相對位置和分布來解析成年鼠肺間充質(zhì)隔室的復(fù)雜性。Wnt-反應(yīng)的Axin2+細(xì)胞可以在整個成年鼠肺間質(zhì)、肺泡區(qū)和周圍的導(dǎo)管氣道和血管中發(fā)現(xiàn)（圖1A-1D和圖2A-2D）。肺泡中許多Axin2-衍生細(xì)胞表達(dá)Pdgfrɑ，而Axin2+伴隨氣道的譜系跟蹤細(xì)胞主要表達(dá)Pdgfrβ（圖1E-1H）。 ? 圖2 信號追蹤鑒定成年小鼠肺中不同的間充質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的AXIN2表征 ? 使用Wnt2CreERT2與R26REYFP示蹤基因雜交，我們證明Wnt2+細(xì)胞僅分布于肺的肺泡區(qū)域。此外，使用免疫染色Wnt2CreERT2：R26RtdT：Pdgfrɑ小鼠，PdgfrɑEGFP示蹤數(shù)據(jù)表明，肺泡間充質(zhì)細(xì)胞是區(qū)域分布的，可以根據(jù)Axin2，Wnt2和Pdgfrɑ的表達(dá)分為幾種不同的類型?？傮w而言，在肺泡區(qū)域發(fā)現(xiàn)Axin2+/Pdgfrɑ+細(xì)胞和Wnt2+/Pdgfrɑ+細(xì)胞，而Axin2+/Pdgfrɑ細(xì)胞主要存在于周圍的氣道或血管中，表明這些不同譜系中的每一個在肺中具有獨特的空間位置（圖3）。 ? 圖3 免疫組織化學(xué)染色追蹤特征基因在不同細(xì)胞的表達(dá)及間充質(zhì)細(xì)胞種群的分布圖 ? 3.2 譜系特異性和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析揭示了成熟肺中獨特的間充質(zhì)譜系。 為了進(jìn)一步評估上述各種間充質(zhì)細(xì)胞類型，我們進(jìn)行了群體RNA測序分析和單細(xì)胞RNA測序分析。為了獲得上述五種不同細(xì)胞群的深度測序，基于存在或不存在Axin2，Pdgfrɑ和Wnt2表達(dá)（圖4A和圖5E、F、G），使用熒光激活細(xì)胞分選來分離這些細(xì)胞。 ? 圖4 肺間質(zhì)細(xì)胞具有不同的轉(zhuǎn)錄組 ? ? 圖5 為每個肺制備單細(xì)胞懸液，對于肺間質(zhì)的FACS分離 ? 熒光激活細(xì)胞分選能夠分離大于90％的肺中的活Epcam-/CD31-/CD45-細(xì)胞群體，構(gòu)成絕大多數(shù)的肺間充質(zhì)隔室（圖6H、I）。 ? 圖6 Axin2-tdTomato標(biāo)記了成年鼠肺的所有細(xì)胞的約36.6％ ? 群體RNA測序數(shù)據(jù)的主成分分析（PCA）顯示，所有五個群體都顯示出顯著不同的轉(zhuǎn)錄組（圖7B）。 ? 圖7 來自五個間充質(zhì)群體的群體RNA測序的三維主成分分析（PCA）; n = 2只小鼠 ? 已知的間質(zhì)標(biāo)志物，包括群體RNA測序數(shù)據(jù)中的信號傳導(dǎo)和結(jié)構(gòu)基因的分析顯示，“其他”和Axin2+細(xì)胞表現(xiàn)出具有豐富的基因表達(dá)的平滑肌，肌成纖維細(xì)胞或周圍細(xì)胞樣細(xì)胞的特征，例如Acta2，Tagln和Des（圖8A、D）。Pdgfrɑ+，Axin2-Pɑ+和Wnt2+細(xì)胞表現(xiàn)出與在肺泡中發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)生基質(zhì)的成纖維細(xì)胞相關(guān)的基因的富集表達(dá)，如Elastin(Eln),Pdgfrɑ(Pdgfrɑ)和Collagen(Col1a1)（圖8）。 ? 圖8 所選譜系富集基因的熱圖。五個不同細(xì)胞群體中每一個的特定基因的簡要列表顯示在右側(cè)D ? 在間質(zhì)中表達(dá)的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記，富含Axin2+細(xì)胞，用于指示肌成纖維細(xì)胞譜系的基因，包括Acta2和Aoc3。分析顯示，通過功能性報告讀數(shù)識別的不同間充質(zhì)細(xì)胞類型代表不同的簇，來源于簇4(C4)表示的Axin2+細(xì)胞，簇2（C2）表示的Axin2-Pɑ+細(xì)胞，Wnt2+由簇1（C1）表示的細(xì)胞（圖9）。 ? 圖9 來自譜系和單細(xì)胞RNA測序的間質(zhì)標(biāo)記表達(dá) ? 使整個肺間充質(zhì)群體進(jìn)行插入型單細(xì)胞RNA測序分析（圖4A）。評估來自5,572個肺間質(zhì)細(xì)胞的單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)，t分布隨機(jī)相鄰嵌入(t-SNE)的聚類分為五個不同的組，每組由超過90個單元組成（圖10）。一些候選間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)顯示簇4和5含有大部分Pdgfrɑ+細(xì)胞，簇2和3包含大多數(shù)Acta2-，Tagln-和Des-表達(dá)細(xì)胞（圖10）。在第2,3,4組中表達(dá)了Pdgfrβ，Col1a1在所有簇中均被廣泛表達(dá)（圖10C）。 ? 圖10 使用K-means（K = 10）的5,572個細(xì)胞的單細(xì)胞RNA-seq應(yīng)用于二維tSNE圖以鑒定不同的間充質(zhì)細(xì)胞群，每個簇中的最高度表達(dá)的基因分析表明，集群5代表上皮細(xì)胞沒有使用流式細(xì)胞儀分離除去 ? 圖11 從1-5列中的頂級基因產(chǎn)生的熱圖，右側(cè)概述，log2倍變化大于2，p值小于0.05 ? 3.3 用空間距離映射算法對肺泡壁龕中上皮間充質(zhì)相互作用的研究。 為了確定上述定義的間充質(zhì)譜系有助于形成具有AT2細(xì)胞群體的肺泡利基，我們開發(fā)了使用AT2細(xì)胞作為錨點的空間距離映射算法（圖12A），為我們發(fā)現(xiàn)的每個間充質(zhì)譜系定義一個獨特的空間地址。SDM基于使用共聚焦顯微鏡的三維渲染以使用DAPI染色測量核-核的距離來鑒定所述細(xì)胞類型與表達(dá)Sftpc的AT2細(xì)胞的相對位置（圖12B）。鑒于它們優(yōu)先靠近AT2細(xì)胞，這些數(shù)據(jù)表明Axin2-Pɑ+間充質(zhì)譜系是可能優(yōu)先與AT2細(xì)胞通信的肺泡利基的關(guān)鍵組分（圖12J） ? 圖12 距離定位肺中的肺泡利基 ? ? 本研究通過群體單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序構(gòu)建了肺間質(zhì)的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜。間充質(zhì)肺泡壁龕細(xì)胞主要是Wnt應(yīng)答，表達(dá)Pdgfra，并且是肺泡上皮細(xì)胞生長和自我更新的關(guān)鍵。而Axin2+的肌纖維祖細(xì)胞在損傷后首先分化成具有病理損害的肌纖維細(xì)胞。這些研究定義了肺間質(zhì)的細(xì)胞種類和分子框架，并展示了在組織損傷后自我更新對抗病理反應(yīng)的重要的發(fā)育通路。為肺部損傷治療提供了重要的參考。 ? 群體單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序解析Lgr5+腸道干細(xì)胞自我更新過程中Wnt和R-spondin（蛋白配體）的不等效性 ? Non-equivalence of Wnt and R-spondin ligands during Lgr5+intestinal stem-cell self-renewal 期刊：《Nature》，2017.03 影響因子 ：38.138 發(fā)表單位：美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院 ? ? 典型的Wnt信號通路和β-連環(huán)蛋白信號通路控制著不同的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和病理過程。Wnt配體與受體LRP5、LRP6等，使β-連環(huán)蛋白的核轉(zhuǎn)位和依賴TCF/LEF的基因轉(zhuǎn)錄。蛋白配體(RSPO1 -RSPO4)作用于不同的LGR-LGR6、RNF43和ZNRF3受體，其能增強(qiáng)Wnt /β-catenin信號，在體外誘導(dǎo)腸道器官的生長，在體內(nèi)誘導(dǎo)Lgr5+腸干細(xì)胞分化。然而，Wnt與蛋白配體(RSPO)的互換性、功能合作和相對貢獻(xiàn)在體內(nèi)調(diào)控Wnt信號和腸道干細(xì)胞生物學(xué)中仍然未知。本文通過群體單細(xì)胞測序探索腸道干細(xì)胞自我更新過程中Wnt信號的作用機(jī)制。 ? ? 2.1 小鼠體內(nèi)注射腺病毒編碼Wnt和RSPO激動劑或抑制劑26h，然后取近端空場消化為細(xì)胞懸液； ? 2.2 使用GemCode系統(tǒng)流式分選了13,102個Lgr5-eGFP+細(xì)胞，單細(xì)胞捕獲效率超過50％； ? 2.3 用FACS凈化的近端空腸Lgr5-eGFP+細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序。 ? ? 3.1 LGR5-,RNF43-和ZNRF3-ECD誘導(dǎo)的Lgr5+ISCs的消耗不是由于隱窩細(xì)胞凋亡或增殖改變的。 用RSPO受體LGR5、ZNRF3或RNF43的可溶性胞外區(qū)(ECDs)來抑制內(nèi)源性RSPO信號，并將RSPO1-RSPO4結(jié)合在一起。小鼠靜脈注射腺病毒大約14-96天后，在肝臟轉(zhuǎn)導(dǎo)和分泌，強(qiáng)烈表達(dá)人LGR5、小鼠ZNRF3或小鼠RNF43的ECDs（圖13）。 ? 圖13 單次靜脈注射腺病毒至C57B1小鼠后血清表達(dá)的時間過程 ? 為了檢測pan-RSPO1-RSPO4抑制對Lgr5+胞外區(qū)的影響，小鼠靜脈內(nèi)注射編碼LGR5 ECD，ZNRF3 ECD或RNF43 ECD的腺病毒或編碼IgG2ɑFc的對照腺病毒。RSPO1過表達(dá)扭轉(zhuǎn)了雙胞外區(qū)（ECDs），但沒有Ad-Dkk1表型(圖14a)。盡管定量Lgr5+ECD耗竭，單一LGR5, RNF43 或ZNRF3-ECD仍保留了隱窩增殖和Axin2-LacZ 報告信號(圖14a,d)，可歸因于剩余的傳輸擴(kuò)增細(xì)胞或非蛋白配體(rspo)依賴性群體。 ? 圖14 a上部：LGR5、RNF43或ZNRF3 ECD在注射后2-14天可逆地消融小腸中eGFP標(biāo)記的Lgr5細(xì)胞的表達(dá)，下部：血紅素和伊紅染色(H&E)染色 ? 圖14 d單而非雙ECD RSPO抑制在axin2-lacz Wnt報告小鼠中保存Ki67+隱窩增殖和隱窩基底Wnt信號 ?
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