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新型雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀給蛋白質(zhì)組學(xué)帶來(lái)革命性變化

Tonya Pekar Second, Justin Blethrow, Jae C. Schwartz, Vlad Zabrouskov, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA

關(guān)鍵詞：

LTQ Velos? 線性離子阱，蛋白質(zhì)學(xué)，蛋白鑒定，肽測(cè)序、靈敏度、蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)者

引言：

對(duì)于一個(gè)蛋白質(zhì)組全面的了解是研究動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)組的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)的鑒定是需要有效、穩(wěn)定可靠的方法。串聯(lián)質(zhì)譜尤其是線性離子阱和基于阱的雜交質(zhì)譜儀日益成為肽段和蛋白質(zhì)鑒定的首選。選擇此類儀器的主要原因在于該類儀器具有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、易用性以及良好的一級(jí)和二級(jí)譜圖質(zhì)量。

在一個(gè)蛋白質(zhì)組體系里，經(jīng)常會(huì)存在一些低豐度不易被質(zhì)譜儀鑒定到的蛋白，其中某些蛋白還會(huì)存在一些動(dòng)態(tài)修飾，就更難被儀器檢測(cè)到。因此，需要發(fā)展更先進(jìn)靈敏度更高的一切來(lái)應(yīng)對(duì)復(fù)雜蛋白質(zhì)組蛋白鑒定的需求。

本篇應(yīng)用論文主要介紹了用新型雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀分析復(fù)雜、Caenorbabditis elgans(C.elegans)的肽段混合物。比較了新型雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀與線性離子阱和廣泛應(yīng)用的四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的性能。

儀器創(chuàng)新

在本篇文章主要測(cè)試Thermo Scientific 的LTQ Velos離子阱質(zhì)譜儀。它包括了一個(gè)新型雙壓線性離子阱和高壓環(huán)形離子導(dǎo)入裝置（S-Lens），如圖1所示。

S-lens的射頻顯著提高了離子注入到質(zhì)譜儀中，這降低了在線性離子阱中離子累積所需要的時(shí)間。

雙壓阱的第一個(gè)池的壓力比以前線性離子阱的壓力要高，大約在5×10-3Torr，這能夠顯著提高目標(biāo)離子的捕獲效率、分離效率和碎裂效率。提高的分離效率顯著降低了前體離子所需要的時(shí)間，所需時(shí)間是從前的四分之一。LTQ Velos離子阱對(duì)于在有高豐度干擾離子背景下低豐度前體離子具有較好的選擇性，提高了二級(jí)質(zhì)譜分析的動(dòng)態(tài)范圍。高壓也縮短了碰撞誘導(dǎo)解離所需的時(shí)間的67%，同時(shí)保持了同樣的碎裂效率。第二個(gè)池保持較低的壓力，大約在4×10-4Torr，可以以較高的分辨率進(jìn)行快速質(zhì)量分析。

高捕獲效率

高裂解效率

高分離效率

5×10-3? 氦氣

高分辨率、掃描速度

3.5×10-4? 氦氣

圖一 LTQ Velos 質(zhì)譜儀，高壓環(huán)形離子導(dǎo)入裝置（S-Lens）和新型雙壓線性離子阱（不同壓力控制）

與新型雙壓線性離子阱協(xié)力合作，在典型的數(shù)據(jù)依賴模式的串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中，在阱里一種新型控制離子累積的方法能顯著提高實(shí)際的掃描速率。這個(gè)功能叫做“預(yù)測(cè)AGC”，去除了每一次串聯(lián)質(zhì)譜掃描所做的預(yù)掃，基于離子流出和前一次一級(jí)質(zhì)譜全掃描的母離子的相對(duì)強(qiáng)度，預(yù)測(cè)了離子累積所需要的時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)

樣品制備

C.elgans勻漿液的可溶性部分用pH7.8的碳酸氫銨稀釋，加入0.1%的RapiGest表面活性劑，解釋用二硫蘇糖醇在100℃還原二硫鍵，并用碘乙酰胺對(duì)半胱氨酸烷基化。樣品解釋用對(duì)K/R特異性酶酶切4個(gè)小時(shí)。酶解物質(zhì)酸化后存放至-80℃。在進(jìn)入反相高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜前用0.1%的甲酸稀釋。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

為了比較和評(píng)估性能，在Thermo Scientific的LTQ XL線性離子阱質(zhì)譜儀和安捷倫6520四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀一級(jí)LTQ Velos雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀對(duì)C.elegans的蛋白酶解物進(jìn)行了分析，肽段混合物是在反相色譜進(jìn)行分離的。詳細(xì)的色譜條件請(qǐng)參照表1。同時(shí)對(duì)減少進(jìn)樣量進(jìn)行了考察。

在所有實(shí)驗(yàn)中，均采用數(shù)據(jù)依賴的串聯(lián)質(zhì)譜采集方法。在每一臺(tái)儀器上至少運(yùn)行3次樣品。

對(duì)于線性離子阱的數(shù)據(jù)依賴模式檢測(cè)方法，該方法主要分析十個(gè)最強(qiáng)的離子，根據(jù)色譜峰的峰寬，優(yōu)化排除條件，色譜峰的峰寬主要是根據(jù)反相梯度長(zhǎng)度變化。由于在LTQ Velos質(zhì)譜儀離子源有較好的離子傳輸，因此一級(jí)質(zhì)譜全掃描需要較低的最大注射時(shí)間。在進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描的時(shí)候，可用同樣的最大注射時(shí)間，這樣可以捕獲更多的例子，進(jìn)而鑒定得到低豐度的肽段（前體離子豐度較低，AGC的注射時(shí)間達(dá)到最大）。在LTQ Velos前體離子的選擇上采用數(shù)據(jù)依賴的模式，對(duì)一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)設(shè)置更高的閾值。離子轉(zhuǎn)移管的溫度為250℃，比LTQ XL更高，目的是補(bǔ)償短的毛細(xì)管長(zhǎng)度。碰撞誘導(dǎo)解離的時(shí)間從30ms降至10ms，充分利用更高的壓力池，提高碎裂效率。LTQ Velos雙壓離子阱對(duì)于正常掃描模式同時(shí)提供了碎裂效率和掃描速率，而且阻止了單電荷的前體離子的傳輸。在數(shù)據(jù)采集模式充分利用了這個(gè)特點(diǎn)，詳細(xì)的采集參數(shù)如表2所示。

6520四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Q-TOF）的采集參數(shù)如表3所示。采用了3Hz和6Hz的掃描速率，以最大化實(shí)現(xiàn)對(duì)肽段進(jìn)行鑒定，實(shí)際有效的掃描速率為2.5Hz或5.1Hz。參數(shù)設(shè)置參考了安捷倫的技術(shù)支持，同時(shí)也與推薦文獻(xiàn)報(bào)道相類似。

數(shù)據(jù)庫(kù)搜索

通過(guò)用Thermo Scientific蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)1.0（Proteome Discovery)軟件和英國(guó)倫敦Matrix Sciences公司的Mascot2.1搜索引擎對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索，比較離子阱和四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀所采集的數(shù)據(jù)。用于數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的條件如表4所示。在Mascot中選中反相庫(kù)檢索選項(xiàng)，對(duì)所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，保證1%或更低的的假陽(yáng)性率。用安捷倫的軟件Masshunter將6520的四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀所采集的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzdata格式，然后提交到蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)（Proteome Discovery)軟件。Proteome Discovery軟件會(huì)自動(dòng)計(jì)算期望得分（或肽得分，如果選中的話）來(lái)過(guò)濾數(shù)據(jù)，達(dá)到滿足特定的假陽(yáng)性率，然后將該過(guò)濾方法應(yīng)用到數(shù)據(jù)集中。

因此，選擇高置信度的肽段過(guò)濾條件來(lái)使最終檢測(cè)到的蛋白滿足1%或更低的的假陽(yáng)性率。將數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到的特異性肽段的數(shù)量和蛋白數(shù)進(jìn)行比較。

表1 肽段一維反相色譜分離條件

表2： LTQ Velos and LTQ XL 質(zhì)譜