Fang Chen, Christopher Comeau, Jillian Mason, Carrie Ann Brown, and Christopher J. Fry. Cell Signaling Technology, Inc., Danvers MA 01923.
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講座內(nèi)容
本講座將重點討論CUT&RUN的基本原理，以及在設(shè)計實驗時需要考慮的重要因素。此外，我還將介紹Cell Signaling Technology（CST）的CUT&RUN Assay Kit（#86652）和CUT&RUN pAG-MNase酶，相關(guān)數(shù)據(jù)顯示它能適用于多種細胞類型的組蛋白修飾，轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔助因子的研究。
與染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP) 檢測一樣，核酸酶靶向切割和釋放 (CUT&RUN) 是一項用于在細胞天然染色質(zhì)環(huán)境下檢測蛋白-DNA 相互作用的強大通用技術(shù) (1-4)。這種測定法可用于檢測與基因組某個特定區(qū)域有關(guān)的多種蛋白，或相反，用于檢測與某種特殊蛋白有關(guān)的基因組的多個區(qū)域。此外，CUT&RUN 測定法可用于明確某種特殊蛋白-DNA 相互作用的空間和時間關(guān)系。例如，CUT&RUN 檢測可用于確定各種蛋白因子被募集到某個基因啟動子上的特定順序，或用于“測定”基因激活期間整個基因位點上某種特殊組蛋白修飾的相對量。除了組蛋白，CUT&RUN 測定法還可用于分析轉(zhuǎn)錄因子和輔因子結(jié)合、DNA 復制因子和 DNA 修復蛋白的結(jié)合。
CUT&RUN 提供了一種檢測細胞中蛋白-DNA 相互作用的快速、可靠且真正的低細胞數(shù)測定法。與 ChIP 實驗不同，CUT&RUN 不存在甲醛交聯(lián)、染色質(zhì)碎裂和免疫沉淀，使之成為一種使蛋白-DNA 相互作用富集和檢測靶基因的更快且更有效的方法。CUT&RUN 可在一天之內(nèi)完成從活細胞到純化 DNA 的過程，且經(jīng)證明每次檢測只需使用少至 500-1000 個細胞 (1,2)。和 ChIP 中碎裂所有細胞染色質(zhì)不同，CUT&RUN 利用一種染色質(zhì)抗體靶向消化方法，從而使背景信號比 ChIP 實驗低得多。因此，CUT&RUN 僅需 ChIP-seq 檢測所需測序深度的 1/10 (1,2)。最后，加入簡單的Spike-in DNA 即可準確定量和標準化靶標蛋白結(jié)合，而這是 ChIP 方法無法實現(xiàn)的。這種方法可有效標準化樣品間和實驗間的信號。
參考文獻
1.Skene, P.J. and Henikoff, S. (2017) Elife 6, pii: e21856. doi: 10.7554/eLife.21856.
2.Skene, P.J. et al. (2018) Nat Protoc 13, 1006-19.
3.Meers, M.P. et al. (2019) Elife 8, pii: e46314. doi: 10.7554/eLife.46314.
4.Meers, M.P. et al. (2019) Mol Cell 75, 562-575.e5.
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講師簡介
陳芳 博士 (CST Senior Development Scientist / 美國總公司資深研發(fā)科學家)
博后: 耶魯大學
博士: 中科院上海生命科學研究院
具有10年以上表觀遺傳相關(guān)技術(shù)的研發(fā)與應用經(jīng)驗，對在植物，癌細胞，動物組織等各種材料中蛋白質(zhì)與DNA的互作都具有深厚的學術(shù)積累。組織參與了CST各種表觀試劑盒及相關(guān)抗體的研發(fā)和驗證，包括CUT&RUN試劑盒，酶解ChIP試劑盒，超聲ChIP試劑盒，測序文庫制備試劑盒等。此外陳芳博士長期活躍于客戶服務(wù)和技術(shù)支持的一線，直接接觸來自全球的大量科研用戶，深諳實驗痛點，積累了豐富的研發(fā)經(jīng)驗及產(chǎn)品知識，希望能為廣大科研工作者提供幫助。
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