Cisbio 的 Tag-lite HTRF 平臺能 夠 有效 地 用 HTRF 熒 光
團(tuán)標(biāo)記目標(biāo)位點(diǎn)上感興趣的蛋白。細(xì)胞表面受體可以插
入 SNAP-tag 質(zhì)粒中，然后用這種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染細(xì)胞并表達(dá)
標(biāo)記的受體。通過添加 snap -lumi4-Tb 底物，用鋱 (Tb)
穴狀化合物標(biāo)記受體。為了進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)，受體的配體
用 HTRF 受體熒光團(tuán)標(biāo)記，例如 d2。當(dāng) d2 配體與鋱標(biāo)
記的受體結(jié)合時，可以使用具備 HTRF 功能的微孔板讀
板機(jī)檢測受體到配體的時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (TRFRET) ( 圖 1)。
Cisbio 提供了多種標(biāo)簽和興趣蛋白標(biāo)記編碼的質(zhì)粒，以
及已經(jīng)用這些結(jié)構(gòu)物轉(zhuǎn)染的冷凍細(xì)胞。該結(jié)構(gòu)體能夠表
達(dá)標(biāo)記蛋白，如受體，可以用鋱標(biāo)記，同時其受體配體
( 激動劑或拮抗劑 ) 用受體熒光團(tuán)標(biāo)記。Tag-lite 平臺適
用于廣泛的應(yīng)用，如受體二聚化、配體結(jié)合分析和第二信
使評估。結(jié)合動力學(xué)可以研究藥物 - 蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)
合和解離速率，是優(yōu)化候選藥物體內(nèi)療效的必要步驟 1。
優(yōu)勢
? 提供可靠的，免洗的飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)
? Cisbio HTRF 平臺提供多種配置實(shí)驗(yàn)和試劑的選項(xiàng)
? 已有經(jīng)過認(rèn)證的 HTRF 儀器，確保儀器性能
APPLICATION NOTE
利用基于 HTRF 的 Tag-lite 技術(shù)檢測胰高血糖
素 GLP-1 受體的 Kd 值
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胰高血糖素樣肽 -1 受體 (GLP1R) 在胰腺細(xì)胞中表達(dá)，其
激活刺激腺苷酸環(huán)化酶途徑，導(dǎo)致胰島素合成和釋放增
加。因此，GLP1R 被認(rèn)為是治療糖尿病的一個潛在靶點(diǎn) 2。
GLP1R 也在大腦中表達(dá)，它參與控制食欲，并在記憶和
學(xué)習(xí)機(jī)制中具有潛在的重要作用。
在 這 里， 我 們 展 示 了 如 何 使 用 SpectraMax?i3x 和
SpectraMax?iD5 多功能微孔 板讀板機(jī)使 用 HTRF 進(jìn) 行
可靠的、免洗飽和結(jié)合分析。使用 Tag-lite 技術(shù)在 HTRF
認(rèn)證的 SpectraMax i3x 和 iD5 讀板機(jī)上評估 GLP1R 配
體的結(jié)合。
飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)
配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)是評估特定配體與受體親和力的重要手段，
也是理解受體和配體相互作用機(jī)制的關(guān)鍵。結(jié)合研究因
此成為藥物發(fā)現(xiàn)過程的一部分，有助于設(shè)計(jì)出高選擇性
和特異性結(jié)合靶標(biāo)藥物。結(jié)合活性決定了單個生物分子
之間的結(jié)合作用，如受體及其配體 ( 如激動劑 )。它通常
用飽和分析來檢測，用平衡解離常數(shù) (Kd) 來表示。Kd
用于評估配體與其靶標(biāo)之間的相互作用強(qiáng)度并對其作用
強(qiáng)弱程度進(jìn)行排序。Kd 值越小，配體與靶標(biāo)的結(jié)合親和
力越大。在競爭或抑制研究中，選擇合適的配體濃度是
準(zhǔn)確測定 IC50 和抑制常數(shù) (Ki) 的必要條件。一般來說，
濃度達(dá)到或略低于 Kd 值是可以接受的。使用高于 Kd 值
的配體濃度會使藥物看起來不如它們在體內(nèi)的效力。
飽和結(jié)合試驗(yàn)檢測總結(jié)合和非特異性結(jié)合濃度增加的配
體 ( 圖 2 )。熒光配體滴定到含有固定數(shù)量標(biāo)記細(xì)胞的溶
液中，孵育至平衡。當(dāng)熒光配體與受體結(jié)合時，TR-FRET
發(fā)生，并通過 HTRF 認(rèn)證的微孔板讀板機(jī)進(jìn)行檢測。得
到的 HTRF 比率代表總結(jié)合。非特異性結(jié)合方式作為陰
性對照，其使用未標(biāo)記的配體進(jìn)行檢測，說明已標(biāo)記的
配體與受體、非受體分子或微板的非特異性結(jié)合 2。
檢測時，將熒光標(biāo)記的配體滴定到含有固定數(shù)量標(biāo)記細(xì)
胞和 100 倍摩爾濃度的未標(biāo)記配體的溶液中。標(biāo)記的和
未標(biāo)記的配體競爭與標(biāo)記的 GPCR 結(jié)合。由于非特異性
配體過多，它會與受體結(jié)合，所以不會發(fā)生 TR-FRET。從
這種滴定法得到的 HTRF 比率代表非特異性結(jié)合。通過
從每個熒光標(biāo)記配體濃度的總結(jié)合減去非特異性結(jié)合來
計(jì)算特異性結(jié)合。
圖 1 Tag-lite 細(xì)胞表面結(jié)合實(shí)驗(yàn)示例。GPCR 興趣基因序列插入到 SNAP-tag 質(zhì)粒中，然后細(xì)胞轉(zhuǎn)染并表達(dá)該受體，GPCR 通過添加
snap -lumi4-Tb 底物共價標(biāo)記一個穴狀化合物供體。最后結(jié)合實(shí)驗(yàn)使用標(biāo)記配體實(shí)現(xiàn)。
2 4
Tag-light
SNAP-tag
plasmid
GPCR-expressing
Tag-light cell
Pre-labeled
Tag-light cell
1 3 5
Tag-light
CGCR
plasmid
Transfection
GPCR labeling with
SNAP-Lumi4-TB substrate
Binding
assay
Labeled-ligand
displacement
with competing
compound
N N H
NH
N 2
N
O
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材料：
? Tag-lite GLP1R 表達(dá)，Tb 標(biāo)記的冷凍細(xì)胞 (Cisbio cat.
#C1TT1GLP1)
? Tag-lite 緩沖液 (Cisbio cat. #LABMED)
? GLP1 受體紅色激動劑 (Cisbio cat. #L0030red)
? 毒晰外泌肽 4
(Exendin 4，Sigma-Aldrich cat.# 1269105)
? 白色，低體積 384 孔微孔板 (Greiner cat. #784075)
? 帶 有 HTRF 檢 測 卡 盒 (Molecular Devices cat. #0200-
7011) 的 SpectraMax i3x 多功能微孔板讀板機(jī) (Molecular Devices cat. #i3x)
? 帶 有 HTRF 檢 測 系 統(tǒng) (Molecular Devices cat. #6590-
0144, 包含增強(qiáng)型 TRF 模塊及 HTRF 濾光片 )
方法
細(xì)胞
根據(jù)產(chǎn)品說明準(zhǔn)備細(xì)胞，冷凍的細(xì)胞在 37℃ 解凍，轉(zhuǎn)移
到含有 5 ml 1x Tag-lite 緩沖液 (TLB) 的試管中。4℃，
1200g，離心 5 min。吸出上清液，重懸于 2.7 ml 的 1x
TLB 中。
熒光標(biāo)記配體
GLP1 受體紅色激動劑是一種用紅色熒光 HTRF 探針標(biāo)記
的 Exendin 4 衍生物。將原漿濃度稀釋于 1X TLB 中制備
400 nM 濃度的紅色激動劑 ( 原漿濃度見試劑盒說明書 )。
10 個額外的 1:2 稀釋，然后用 1X TLB 得到最終濃度從
100 nM 到 0.097 nM。
非標(biāo)記配體
稀 釋 原 溶 液 到 1 x TLB ( 見 產(chǎn)品說 明 ) 制 備 40μM 終濃
度無標(biāo)記 Exendin 4 配體。這相當(dāng)于最大標(biāo)記配體濃度
400 nM 的 100 倍摩爾。
Total binding measurement
Non-specific binding measurement
圖 2 Tag-lite 飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)。總結(jié)和檢測通過熒光配體與受體的結(jié)合出現(xiàn)的 TR-FRET 測定。非特異性結(jié)合檢測是通過過量的非標(biāo)記
的配體與熒光標(biāo)記的配體競爭結(jié)合標(biāo)記的 GPCR，未標(biāo)記的配體結(jié)合至受體上 TR-FRET 不會發(fā)生。
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實(shí)驗(yàn)板設(shè)置
按照 Cisbio 配體結(jié)合說明書將試劑分配到板內(nèi) ( 圖 3 )。
384 孔白板孔內(nèi)注入 10 μL GLP1 受體細(xì)胞，5 μL TLB 添
加至總結(jié)和孔內(nèi)，5 μL 未標(biāo)記配體添加至非特異性結(jié)合
圖 3 384 孔低體積微孔板實(shí)驗(yàn)設(shè)置。實(shí)驗(yàn)板在室溫孵育 2 h 后，在 SpectraMax i3x 和 iD5 讀板機(jī)上檢測 TR-FRET ( 見表 1 的儀器設(shè)
置 )
表 1 i3x 和 iD5 的儀器設(shè)置
4
| lls μL |
| Total binding ? μL Non-specific binding Unlabeled ligand ? μL |
ligand
(titration)
? μL
Read on an HTRF
compatible reader
1 3
| Incubate ?h at RT |
1X
SpectraMax i3x reader SpectraMax iD5 reader
Additional components required HTRF Detection Cartridge: P/N 0200-7011 HTRF Detection System: P/N 6590-0144
Excitation 340 nm / 80 nm 340 nm / 70 nm
Emission Donor filter: 620 nm
Acceptor filter: 665 nm
Donor filter: 616/10 nm
Acceptor filter: 665/10 nm
Number of flashes 30 30
Integration delay 30 μs 20 μs
Integration time 400 μs 200 μs
Other settings Read height is easily optimized for different volumes and plate formats
孔中。最終，5 μL GLP1 受體激動劑 exendin 4- 紅色標(biāo)
記物添加到所有孔中。將實(shí)驗(yàn)板在室溫孵育 2 h 并用優(yōu)化
的儀器設(shè)置 ( 表 1 ) 在 SpectraMax i3x 和 iD5 讀板機(jī)上
讀取。兩個讀板機(jī)都進(jìn)行高度優(yōu)化以確保最佳的實(shí)驗(yàn)靈
敏度和動態(tài)范圍。
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數(shù)據(jù)分析
HTRF 分析涉及 Cisbio 的**比率法，該方法基于檢測
到的兩個發(fā)射波長。616 nm 處的供體發(fā)射光被用作內(nèi)
參，而 665 nm 處的受體發(fā)射光被用作測定生物反應(yīng) ( 結(jié)
合 ) 的指示劑。這種比率測量 ( 受體與供體熒光的比率 )
減少了孔間的變異，并消除了化合物干擾。在下面的步驟
4 中計(jì)算的 Delta F，將信號去除背景，對于測定之間的
比較是有用的。根據(jù) 665 nm / 616 nm 的比值計(jì)算結(jié)果，
用 Delta F 表示如下 :
1. Ratio = x 104
Emission665nm
Emission616nm
2. Mean Ratio = ∑ratios
2
3. CV = x 100
Std deviation
Mean ratio
4. Delta F = Standard or sample Ratio?Rationeg x 100
Rationeg
(Rationeg = Ratio of negative control)
數(shù)據(jù)通過 SoftMax? Pro 軟件獲取并分析，軟件內(nèi)已預(yù)置
了 HTRF 的模板可以簡要的檢測和分析。
GLP-1 receptor agonist (nM)
Ratio
| Parameter Kd (nM) | Cisbio’ s predefined value 5 | SpectraMax i3x reader 0.816 | SpectraMax iD5 reader 2.347 |
的比率 ( 藍(lán)色曲線 ) 為總結(jié)合率 ( 紅色曲線 ) 減去各濃度下非特異性結(jié)合率 ( 綠色曲線 ) 的比值。
表 2 Tag-lite 結(jié)合飽和曲線的結(jié)果總結(jié)
結(jié)果
對總結(jié)合孔 和非特異性結(jié)合孔的每個標(biāo)記配體濃度計(jì)
算 HTRF 比率。通過從每個熒光配體濃度下的總結(jié)合減
去非特異性結(jié)合計(jì)算特異性結(jié)合。如上文所述，對數(shù)據(jù)
進(jìn) 行 分析，并 使 用 SoftMax Pro 軟 件進(jìn) 行 雙 直 角雙 曲
線擬合 ( 圖 4 )，得出最佳結(jié)果，讀數(shù)設(shè)置如表 1 所示。
SpectraMax i3x 讀板機(jī)產(chǎn)生的飽和曲線 ( 這里沒有顯示 )
與 SpectraMax iD5 讀板機(jī)類似。在特定飽和曲線中雙直
角雙曲線擬合中擬合參數(shù) B 為 Kd。Cisbio 建立了一個 5
nM 或更低的 Kd 值，以確認(rèn)酶標(biāo)儀能夠成功地測量帶有
紅色受體的 Tag-lite 分析。SpectraMax i3x 讀板機(jī)的 kd
值為 0.816 nM, SpectraMax iD5 讀板機(jī)的 kd 值為 2.347
nM ( 表 2 )，證實(shí)了這兩種儀器檢測這些 Tag-lite 實(shí)驗(yàn)的
能力。