?使用串聯(lián)切向流過(guò)濾高效濃縮慢病毒載體
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簡(jiǎn)介
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VSV-G-假型自我滅活慢病毒載體是不可或缺的生物實(shí)驗(yàn)工具之一，與之前的γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不同的是，慢病毒載體可轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞，并可攜帶更多的轉(zhuǎn)基因盒，在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間也更長(zhǎng)，即可獲得更高的滴度，而其遺傳毒性相對(duì)較低。
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一般情況下產(chǎn)毒細(xì)胞上清液中的載體滴度足以轉(zhuǎn)導(dǎo)常規(guī)細(xì)胞系，但原代細(xì)胞較難轉(zhuǎn)導(dǎo)，需要進(jìn)行載體濃縮以獲得較高濃度。此外，一些載體因整合了會(huì)降低滴度的遺傳元件，且大多數(shù)細(xì)胞類型也不耐受產(chǎn)毒細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基或其分泌蛋白，所以濃縮及清洗是慢病毒載體使用的必要步驟。
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超速離心是病毒顆粒濃縮的常用方法之一，但其濃縮系數(shù)較低，每次處理量也偏小，且繁瑣的多步操作會(huì)降低病毒顆粒回收率。離心過(guò)濾是相對(duì)較簡(jiǎn)單的濃縮方法，但過(guò)濾器本身會(huì)捕獲截留大量載體，造成損耗。相較而言，切向流過(guò)濾（TFF）操作簡(jiǎn)單，損耗低，且可通過(guò)洗濾過(guò)程有效降低產(chǎn)毒細(xì)胞代謝物及分泌蛋白，但傳統(tǒng)的一步式TFF濃縮程度僅可達(dá)50-100倍，本實(shí)驗(yàn)使用兩步TFF，成功將5.5L 慢病毒載體原液濃縮至1mL左右，且回收率高達(dá)97%以上。而對(duì)終產(chǎn)物的質(zhì)量分析顯示，濃縮的慢病毒載體可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)原代人CD34+造血干/祖細(xì)胞和原代人纖維母細(xì)胞，且無(wú)明顯毒性。
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實(shí)驗(yàn)
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實(shí)驗(yàn)使用含pCCL載體質(zhì)粒、gag/pol表達(dá)質(zhì)粒及囊膜表達(dá)質(zhì)粒pMD.G（VSV-G）的轉(zhuǎn)染混合液轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染后進(jìn)行丁酸鈉誘導(dǎo)，培養(yǎng)一定時(shí)間后，分兩次回收含LV培養(yǎng)基，過(guò)0.8μm過(guò)濾器，濾液保存于無(wú)菌容器。
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切向流過(guò)濾使用仕必純KrosFlo研發(fā)用IIi切向流過(guò)濾系統(tǒng)（產(chǎn)品編號(hào)：SYR2-U20-01N），第一步操作時(shí)，系統(tǒng)配用流路1（FP1，產(chǎn)品編號(hào)：EZ-M1-500S-260-01N-1，含500kD中空纖維過(guò)濾器（纖維數(shù)量320，纖維內(nèi)徑0.5mm，膜表面積615cm2）），第二步操作時(shí)，系統(tǒng)配用流路2（FP2，產(chǎn)品編號(hào)：EZ-CHIL07-01-1，含500kD中空纖維過(guò)濾器（纖維數(shù)量12，纖維內(nèi)徑0.5mm，膜表面積40cm2）。
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過(guò)濾前先檢查流路（FP1）完整性，用DPBS完全潤(rùn)濕流路后，運(yùn)行系統(tǒng)，直到DPBS排干，關(guān)閉端口和閥門(mén)，運(yùn)行泵，直到入口壓力達(dá)到5psi左右，打開(kāi)濾液端口，由于空氣不能滲過(guò)潤(rùn)濕的過(guò)濾器纖維，如組件完整，則壓力降不應(yīng)超過(guò)0.01psi/s。
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通過(guò)完整性測(cè)試后，開(kāi)始濃縮含LV培養(yǎng)基。整個(gè)過(guò)程中，監(jiān)測(cè)入口壓力，并維持為6psi以下。第一步操作可將5.5L料液濃縮至50mL，即濃縮100倍左右。濃縮的載體再用1000mL含胎牛血清的洗濾緩沖液進(jìn)行恒量洗濾。之后，將系統(tǒng)流路更換為FP2，通過(guò)完整性測(cè)試后，將第一步獲得的50mL濃縮液進(jìn)一步濃縮至1mL，即總濃縮達(dá)5000倍。該步入口壓力維持為9psi以下。
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隨后，通過(guò)HT-29細(xì)胞載體轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)滴度，并使用多重實(shí)時(shí)PCR技術(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量分析。同時(shí)，以終濃度載體轉(zhuǎn)導(dǎo)原代人CD34+造血干/祖細(xì)胞，確認(rèn)濃縮后載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效力。此外，構(gòu)建針對(duì)誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞（iPSC）生成的復(fù)合STEMCCA 載體，以相同的方法進(jìn)行濃縮，檢測(cè)其轉(zhuǎn)導(dǎo)和重編程原代人纖維母細(xì)胞的能力。
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結(jié)果
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使用TFF進(jìn)行LV濃縮可獲得極高的濃縮系數(shù)和回收率，且對(duì)濃縮后LV的凍融實(shí)驗(yàn)顯示，終產(chǎn)物具有良好的穩(wěn)定性。
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為測(cè)試濃縮LV的質(zhì)量，進(jìn)行了原代人CD34+造血干/祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)導(dǎo)非常成功，且隨載體濃度的增加，轉(zhuǎn)導(dǎo)成功率亦明顯上升，而無(wú)明顯毒性。而在原代人纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，含有高效STEMCCA元件的載體可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)并重編程原代人纖維母細(xì)胞，形成誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞，且成功率隨載體濃度增加而提高。
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討論
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使用兩步切向流過(guò)濾可以高倍數(shù)、高回收率地濃縮LV，工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好。針對(duì)CD34+的轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明濃縮后產(chǎn)物無(wú)明顯毒性，而高濃度STEMCCA載體制備及誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)證明，該工藝可用于大規(guī)模復(fù)雜載體的生產(chǎn)和濃縮。
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問(wèn)題解答 |
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問(wèn)題 |
解決方案 |
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過(guò)濾器完整性測(cè)試失敗 |
更換過(guò)濾器 |
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流路泄漏 |
檢查流路所有連接，如有松動(dòng)，則擰緊 |
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過(guò)濾器阻塞 |
如含LV培養(yǎng)基中有過(guò)多的顆粒或蛋白質(zhì)（血清），則過(guò)濾器可能會(huì)阻塞。可使用無(wú)血清培養(yǎng)基，以降低含LV培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)含量。如使用無(wú)血清培養(yǎng)基，而濾液流速降低，可關(guān)閉濾液端口，增加過(guò)濾器內(nèi)部壓力，以疏通堵塞膜孔 |
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入口壓力過(guò)高 |
降低背壓，并降低流速 |
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聚集 |
如果蛋白質(zhì)清除較多，可能會(huì)導(dǎo)致聚集增加。可在洗濾緩沖液中保留部分蛋白質(zhì)，避免使用純DPBS進(jìn)行洗濾 |
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過(guò)熱 |
FP2在使用時(shí)可能會(huì)變熱，影響載體穩(wěn)定性。可將樣品容器及管路置于冰上進(jìn)行操作。 |
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技術(shù)比較 |
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其它濃縮技術(shù) |
優(yōu)勢(shì) |
劣勢(shì) |
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超速離心 |
原理簡(jiǎn)單，大分子或顆粒等共濃縮成分較少 |
無(wú)法達(dá)到高濃縮倍數(shù)，有污染風(fēng)險(xiǎn)，操作繁瑣，較難進(jìn)行大規(guī)模處理 |
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超濾 |
操作相對(duì)簡(jiǎn)單，可進(jìn)行中等規(guī)模以上的處理 |
無(wú)法達(dá)到高濃縮倍數(shù)，有污染風(fēng)險(xiǎn)，過(guò)濾器截留大量載體造成損耗，負(fù)電荷物質(zhì)形成共濃縮 |
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層析 |
無(wú)需特殊設(shè)備，大分子或顆粒等共濃縮成分較少 |
進(jìn)行大規(guī)模處理非常困難且繁瑣 |
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參考文獻(xiàn)：
Cooper,A.R., Patel,S., Senadheera,S., et al., Highly efficient large-scale vector concentration by tandem tangential flow filtration. Journal of Virological Methods, 2011, 177: 1-9.
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