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如何優(yōu)化SpectraMax Paradigm多功能微孔板檢測儀進(jìn)行Transcreener熒光偏振檢測試驗(yàn)

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簡介

這篇文章主要描述了當(dāng)使用Molecular Devices公司推出的SpectraMax? Paradigm? 微孔板檢測儀檢測Bellbrook 實(shí)驗(yàn)室的Transcreener熒光偏振系列試劑盒時(shí)，如何對儀器參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以滿足其驗(yàn)證要求。

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???????????? Transcreener ADP2 FP (3010)

???????????? Transcreener AMP/GMP (3006)

???????????? Transcreener UDP FP (3007)

???????????? Transcreener GDP FP (3009)

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Transcreener高通量篩選試驗(yàn)是基于對體系內(nèi)數(shù)千種不同細(xì)胞酶在催化底物時(shí)獲得ADP后，檢測其ADP含量的一種通用性，高通量生化檢測平臺。這些酶中的大部分能催化細(xì)胞信號通路中的共價(jià)反應(yīng)，是藥物篩選的高價(jià)值靶點(diǎn)。Transcreener 熒光偏振試驗(yàn)采用單步、免疫競爭法，直接檢測標(biāo)記有遠(yuǎn)紅外熒光示蹤分子的核苷酸偏振值，其所有試驗(yàn)的檢測試劑均由遠(yuǎn)紅外熒光示蹤分子與高特異性的單克隆或多克隆抗體結(jié)合而成，原理是在靶標(biāo)酶催化底物后，所產(chǎn)生的核苷二磷酸或者單核苷酸競爭性的取代了抗體連接的遠(yuǎn)紅外熒光示蹤分子，其遠(yuǎn)紅外熒光示蹤分子的旋轉(zhuǎn)自由度增高，導(dǎo)致熒光偏振現(xiàn)象的減弱（如圖1），使用遠(yuǎn)紅外熒光示蹤分子可以有效降低熒光化合物和光散射的干擾，Transcreener 熒光偏振試驗(yàn)均采用一步添加，混勻既讀的方式，特別適合高通量篩選。

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Transcreener 熒光偏振試驗(yàn)原理（圖一）

SpectraMax Paradigm多功能微孔板檢測儀采用靈活的卡盒式設(shè)計(jì)，可以針對不同試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)類型選擇最適合的檢測卡盒以獲得最佳檢測結(jié)果，儀器所具有雙光電倍增二極管（PMT）能夠同時(shí)工作，用以檢測熒光偏振信號值，做到在不降低檢測靈敏度的同時(shí)提高其檢測速度。儀器不但可以支持1536孔板且能夠與MD公司推出的StakMax?堆板機(jī)進(jìn)行整合，大大增加了檢測的速度和通量。針對Transcreener熒光偏振試驗(yàn)的特點(diǎn)對儀器進(jìn)行優(yōu)化設(shè)置后，SpectraMax Paradigm多功能微孔板檢測儀的表現(xiàn)完全超過了試驗(yàn)本身對儀器性能的要求。

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驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)

為了發(fā)揮Transcreener高通量篩選檢測試驗(yàn)的優(yōu)勢，其中關(guān)鍵性因素是如何對微孔板檢測儀進(jìn)行參數(shù)上的設(shè)置和優(yōu)化，無論是針對那種類型的檢測試驗(yàn)，正確的參數(shù)設(shè)置和優(yōu)化都會增加其檢測的靈敏度。為了找到適合Transcreener高通量篩選試驗(yàn)的最佳參數(shù)設(shè)置，我們做出24條重復(fù)的模擬10uM ATP/ADP酶的反應(yīng)過程的標(biāo)準(zhǔn)曲線。起始濃度為10uM ATP，其中ADP含量的增加與ATP含量的減少是成一定的比例關(guān)系，維持總腺嘌呤核苷酸濃度在10uM左右。通過改變不同的檢測時(shí)間(Integration time)來滿足其試驗(yàn)Z值>0.5的要求，驗(yàn)證一臺儀器是否能夠滿足Transcreener熒光偏振試驗(yàn)的要求，在10uM ATP的轉(zhuǎn)化率為10%的情況其Z值>0.7且ΔmP > 120。

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材料

???????????? ATP/ADP混合物-4 mM MgCl₂、2 mM EGTA、50 mM HEPES、pH 7.5、1% DMSO

0.01% Brij-35和ATP/ADP（腺嘌呤濃度為10uM）

???????????? ADP檢測混合物-1x終止&檢測緩沖液B、4 nM ADP Alexa633示蹤分子和14.8 ug/ml ADP²抗體

???????????? 單示蹤分子-1x終止液&檢測緩沖液B和4 nM ADP Alexa633示蹤分子

???????????? 空白緩沖液-1x終止液&檢測緩沖液B和14.8 ug/ml ADP²抗體

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詳細(xì)的檢測步驟，包括準(zhǔn)備制作標(biāo)曲、請參照Transcreener技術(shù)手冊(http://www.bellbrooklabs.com/transcreener_hts_assays.html)

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方法

試驗(yàn)準(zhǔn)備

步驟一：將10ul的ATP/ADP化合物分別加入384孔板的每行中

步驟二：在這些行中加入10ul ADP混勻

步驟三：加入10ul的10 μM ATP/0 μM ADP化合物于384孔板的行P中

步驟四：在P1-P12行中的每孔中加入10ul的單示蹤分子

步驟五：在P13-P24行中的每孔中加入10ul的空白緩沖液

儀器設(shè)置

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SpectraMax Paradigm微孔板檢測儀由SoftMax? Pro 軟件控制，可以在其軟件模板庫中選擇此試驗(yàn)類型的模版文件并更改其具體的參數(shù)設(shè)置。

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步驟一：打開SoftMax Pro操作軟件，點(diǎn)擊‘Protocol Manager’選項(xiàng)，在其‘Protocol Library’即模版庫中選擇預(yù)先設(shè)置好的模版，在‘Paradigm Protocol’文件夾下選擇‘FP Rhodamine’模版

步驟二：點(diǎn)擊軟件左側(cè)導(dǎo)航樹的‘Plate01’后，再點(diǎn)擊右側(cè)的‘Settings’即設(shè)置按鍵（齒輪狀圖標(biāo)），出現(xiàn)設(shè)置對話框

步驟三：選擇Alexa Fluor633 熒光偏振卡盒

步驟四：檢測模式選擇‘FP’即熒光偏振模式，檢測類型選擇‘Endpoint’即終點(diǎn)法

步驟五：卡盒已固定其檢測波長，無需再設(shè)置

步驟六：點(diǎn)擊‘Plate Type’后選擇‘384 wells’微孔板類型，然后選擇‘384 Well

Corning low vol/rndbtm’