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WB 高背景主要有兩種情況：黑乎乎一片或者零星雜點(diǎn)。這種背景與轉(zhuǎn)膜后的各個(gè)步驟（如封閉、洗膜、抗體和發(fā)光液孵育等）息息相關(guān)。以下我將一一揭秘個(gè)中緣由，還科研一片綠林。
——作者按
Western blot 系列：1. 背景喧賓奪主，怎么破？
情景一：云里霧里
插圖 1，此處假裝云霧彌漫的 WB 圖
原因：
a. 封閉不徹底
b. 洗膜不徹底
c. 試劑（如抗體等）的品質(zhì)及使用
d. 膜變干
e. 印記膜被污染
解決方案：
1. 使用 5% 脫脂奶粉*-TBST* 進(jìn)行封閉，室溫緩慢搖晃封閉 1 h。BSA 并非合適的封閉試劑，對(duì)于磷酸化靶標(biāo)，也需使用脫脂奶粉封閉。
* 脫脂奶粉建議使用實(shí)驗(yàn)級(jí)別奶粉（CST 貨號(hào) #9999），不建議使用食品級(jí)奶粉。
* 熒光 western，則用 TBS。
2. 洗膜的徹底程度與洗膜液成分及時(shí)間有關(guān)。
1) 洗膜液成分：鹽離子和 Tween?20 的濃度是關(guān)鍵，兩者濃度越高，洗滌越徹底。CST 建議使用 137 mM NaCl，20 mM Tris, 0.1% Tween?20 進(jìn)行洗膜。(使用 CST #9997, 或者自行配置，配方見(jiàn)文末)
2) 洗膜時(shí)間：5 min X 3 次。洗膜時(shí)，印記膜盡量不要互相重疊，防止洗膜不徹底。
3. 儲(chǔ)存已久的緩沖液、配置數(shù)天的 5% 脫脂牛奶等，都可能因變質(zhì)而造成背景升高。此外，實(shí)驗(yàn)材料不應(yīng)重復(fù)利用，如濾紙等。
4. 抗體、發(fā)光液的品質(zhì)、使用方法都會(huì)造成背景的產(chǎn)生。
1) 一抗：
1-1) CST：根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)提示，使用 5% BSA-TBST 或 5% 脫脂奶粉-TBST 稀釋；
1-2) 其他：參考供應(yīng)商抗體說(shuō)明書(shū)；
1-3) 根據(jù)說(shuō)明書(shū)，根據(jù)合適的推薦倍數(shù)稀釋。稀釋倍數(shù)過(guò)高或抗體品質(zhì)原因均可造成高背景。
2) 二抗與 ECL 液：使用 5% 脫脂奶粉-TBST 稀釋，稀釋倍數(shù)參考二抗和 ECL 發(fā)光液供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)，根據(jù) ECL 液靈敏度調(diào)整二抗稀釋倍數(shù)；
拿 CST 的二抗稀釋比優(yōu)化方案舉個(gè)栗子
5. 孵育抗體、洗膜時(shí)，使用的液體需足量，防止干膜。孵育時(shí)，注意液體流失或搖床斷電等因素。
6. 操作時(shí)，需全程戴手套，防止手上的油污對(duì)印記膜造成污染。
情景二：星星點(diǎn)點(diǎn)
插圖 2，此處又雙假裝有星星點(diǎn)點(diǎn)的 WB 圖
原因：
a. 轉(zhuǎn)膜后，膜上的殘留凝膠顆粒造成的非特異性結(jié)合；
b. 奶粉未完全溶解；
解決方案：
1. 轉(zhuǎn)膜后，將印記膜在 TBST 中漂洗 5 分鐘，去除殘留凝膠，再進(jìn)行封閉。
CST 使用的 NC 膜（#12369），可在轉(zhuǎn)膜后使用 TBST 洗滌。如為熒光 western，則使用 TBS。
其他生產(chǎn)商的印記膜，可參考供應(yīng)商說(shuō)明書(shū)選擇合適的轉(zhuǎn)膜后洗滌液。
2. 延長(zhǎng)脫脂奶粉與 TBST* 的混勻時(shí)間，使脫脂奶粉徹底混勻。
* 如為熒光 western，則為 TBS。
3. 封閉后可進(jìn)行洗膜，TBST 5 min X 3 次。
配方贈(zèng)送
10 X TBS ：24.2 g Tris Base，80 g NaCl 加入 800 mL ddH2O 中，混勻；調(diào)整 pH 為 7.6；加 ddH2O 定容至 1L。
1XTBST：100 mL 10XTBS，加 ddH2O 稀釋至 1L，加入 1 mL Tween?20，混勻。
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