*以下文章來(lái)源于華盈生物 ，作者瑞瑞
CAR-T療法正在改變腫瘤治療的前景，但其生產(chǎn)本身也面臨一系列挑戰(zhàn)。與大多數(shù)藥物不同，由于CAR-T療法使用患者自己的T細(xì)胞，是高度個(gè)性化的，細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量在批次和患者之間存在顯著差異。在開(kāi)發(fā)過(guò)程中，最重大的挑戰(zhàn)之一是表征制備CAR-T產(chǎn)品的質(zhì)量和效力。IsoPlexis單細(xì)胞功能蛋白組學(xué)技術(shù)可以幫助研究者很好的迎接這方面的挑戰(zhàn)。
IsoPlexis系統(tǒng)檢測(cè)每個(gè)單個(gè)細(xì)胞分泌的特定細(xì)胞因子，并識(shí)別多功能細(xì)胞和細(xì)胞亞群（分泌兩個(gè)或更多細(xì)胞因子），這些亞群在多種研究和疾病治療相關(guān)。IsoPlexis平臺(tái)還可以在表型相同的樣本中檢測(cè)到細(xì)胞功能異質(zhì)性，這些細(xì)胞及其異質(zhì)性帶來(lái)的特質(zhì)會(huì)被流式技術(shù)或群組檢測(cè)的技術(shù)忽略。IsoLight全自動(dòng)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析系統(tǒng)可以對(duì)不同亞群的CAR-T細(xì)胞（CD4+/CD8+）進(jìn)行功能的深度分析，多項(xiàng)研究數(shù)據(jù)顯示CAR-T細(xì)胞的多功能性指數(shù)（PSI）與患者臨床結(jié)果關(guān)聯(lián)，未來(lái)可成為細(xì)胞治療產(chǎn)品的療效預(yù)判與監(jiān)控（圖1）。
圖1單細(xì)胞多功能性指數(shù)成為評(píng)估CAR-T細(xì)胞質(zhì)量的重要指標(biāo)
研究人員使用Miltenyi自動(dòng)化系統(tǒng)進(jìn)行上游的靶向CD19/CD22雙特異性CAR-T制備，接著使用IsoLight單細(xì)胞分析平臺(tái)進(jìn)行下游的細(xì)胞功能質(zhì)量評(píng)估（圖2）。
圖2 IsoLight單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析系統(tǒng)成為CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)工藝中的關(guān)鍵一環(huán)
研究人員采用了兩種生產(chǎn)制備方法，對(duì)比了不同的方法制備的CAR-T細(xì)胞的差異。第一種方法（M1）在第5天以洗滌步驟終止轉(zhuǎn)染，而第二種方法（M2）在第3天終止轉(zhuǎn)染。復(fù)蘇的CAR-T細(xì)胞用抗CD4或抗CD8磁珠分選，并與表達(dá)CD19或CD22抗原的靶細(xì)胞共培養(yǎng)。去除靶細(xì)胞后，將CAR-T細(xì)胞懸液載入IsoCode單細(xì)胞蛋白質(zhì)組芯片，捕獲單細(xì)胞的細(xì)胞因子信號(hào)，數(shù)據(jù)使用IsoSpeak軟件進(jìn)行分析（圖 3）。
圖3 Isoplexis分析CAR-T細(xì)胞的基本流程
結(jié)果表明，無(wú)論是靶向CD19還是CD22的CD4+或者CD8+的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，使用M2方法制備得到的細(xì)胞，細(xì)胞多功能指數(shù)更高(圖4)。即使用M2制備的CAR-T產(chǎn)品表現(xiàn)出更高的多功能性，也表現(xiàn)在效應(yīng)性因子和刺激性細(xì)胞因子的增加。這一單細(xì)胞多功能數(shù)據(jù)清楚地表明，與之前使用的M1相比，M2顯著改善了雙特異性CD19/CD22 CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的功能。
圖4??單細(xì)胞多功能性用于評(píng)估不同制備方法得到的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品
在評(píng)價(jià)CAR-T產(chǎn)品評(píng)價(jià)過(guò)程中，細(xì)胞數(shù)量和活力的增加并不總是與細(xì)胞功能的增強(qiáng)跟最終治療效果正相關(guān)。而Isoplexis單細(xì)胞功能蛋白組分析獲得 的細(xì)胞多功能指數(shù)(Polyfunctional Strength Index PSI)同時(shí)結(jié)合了數(shù)量和活力的維度。PSI同時(shí)涵蓋了細(xì)胞因子分泌的廣度(多功能，即分泌兩個(gè)或更多細(xì)胞因子的單個(gè)CAR-T細(xì)胞)和細(xì)胞因子分泌的強(qiáng)度（分泌量）。PSI可以作為獨(dú)特的標(biāo)尺在治療應(yīng)用之前評(píng)估細(xì)胞產(chǎn)品的效力。
早在2018年一篇Blood雜志文章中研究了治療非霍奇金淋巴瘤(NHL)靶向CD19 CAR-T細(xì)胞，檢測(cè)了在輸注前CAR-T細(xì)胞的多功能性及PSI指數(shù)，并發(fā)現(xiàn)與臨床結(jié)果有正相關(guān)性。研究表明，這些患者輸注前CAR-T的多功能性與患者接受治療后的客觀反應(yīng)(OR)和細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)正相關(guān)性，通過(guò)單細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝾A(yù)測(cè)臨床治療結(jié)果及不良反應(yīng)。PSI可以有效區(qū)分對(duì)治療有應(yīng)答者和無(wú)應(yīng)答者（圖5）。
圖5 CAR-T細(xì)胞PSI與患者預(yù)后具有顯著相關(guān)性
2020年Gastroenterology雜志發(fā)表一項(xiàng)CAR-T改良方法靶向?qū)嶓w瘤的研究。研究對(duì)比分析了靶向肝細(xì)胞癌高表達(dá) 的GPC3兩個(gè)不同抗原表位的CAR-T功效。研究者首先體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了靶向hYP7的CAR-T細(xì)胞比靶向HN3的CAR-T細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤殺傷能力。為了佐證這一結(jié)果，研究者采用了Isoplexis單細(xì)胞功能蛋白組分析兩種CAR-T細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了hYP7-CAR-T細(xì)胞具有更高的多功能性指數(shù)（PSI）。Isoplexis分析結(jié)果和體外效能相一致，為下一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供了重要的質(zhì)控評(píng)估依據(jù)。最終的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了hYP7-CAR-T細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制和消除腫瘤細(xì)胞的能力（圖6）。
圖6 單細(xì)胞功能蛋白組作為CAR-T細(xì)胞功效的質(zhì)量評(píng)估指標(biāo)
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