產(chǎn)品簡介
本制品是采用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行Real Time One Step RT-qPCR的專用試
劑。使用本制品進(jìn)行Real Time One Step RT-qPCR反應(yīng)可在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行，操作
簡單，避免了樣品間交叉污染的同時也提高了檢測的靈敏度。
本試劑盒中的25×RT-PCR Enzyme Mix為TIANGEN新型逆轉(zhuǎn)錄酶(FastKing RTase)、
新型抗體修飾熱啟動Taq DNA聚合酶和RNase Inhibitor的預(yù)混Mix形式，其中的FastKing
RTase，是分子改造后的新型逆轉(zhuǎn)錄酶，特別增加了疏水motif，具有更強的RNA親和性和熱
穩(wěn)定性，提高了該酶的逆轉(zhuǎn)錄效率和對具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)RNA模板的延伸能力；PCR過程中
采用了性能優(yōu)良的新型熱啟動Taq DNA聚合酶，使得逆轉(zhuǎn)錄后的PCR反應(yīng)具更高的擴(kuò)增效率
和特異性。另外，本產(chǎn)品中的2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green)是專門為上述兩
種關(guān)鍵酶而優(yōu)化的新型反應(yīng)體系，其中包含必要離子組分、dNTPs、SYBR Green染料以及
One Step 穩(wěn)定劑和增強劑，可保證FastKing RTase和新型熱啟動Taq DNA聚合酶在整個一
步法反應(yīng)過程中發(fā)揮優(yōu)良功效。
本制品可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對多種高低豐度的靶基因進(jìn)行準(zhǔn)
確定量檢測，重復(fù)性好，可信度高。
產(chǎn)品特點
提高反應(yīng)效率：性能優(yōu)良的逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶保證了高的反應(yīng)效率；
操作簡單快速：雙組分的產(chǎn)品形式使得操作過程變得簡單快速；
通讀復(fù)雜模板：能夠作用于GC含量高，二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA模板；
樣品普適性高：對不同物種來源及雜質(zhì)較多的RNA模板的適用性高。
用戶自己需要準(zhǔn)備的
1. 引物；
2. 模板；
3.一次性手套及其它耗材；
適用范圍
RT-qPCR技術(shù)可用于檢測細(xì)胞和組織中的基因表達(dá)水平及RNA病毒的含量。
操作步驟
1. 完全融化模板RNA，特異性引物，2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green)，
50×ROX Reference Dye和RNase-Free ddH2O，短暫離心后置于冰浴上。
2. 按下表在冰浴條件下配制反應(yīng)液：
組成成分 體積／反應(yīng)
2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green) 25 μl
25×RT-PCR Enzyme Mix 2 μl
上游特異性引物(10 μM) 1.25 μl*1
下游特異性引物(10 μM) 1.25 μl*1
RNA模板 10 pg-1 μg total RNA
50×ROX Reference Dye*2 根據(jù)不同儀器添加
RNase-Free ddH2O 補水至50 μl
總體系 50 μl
*1 引物終濃度為0.25 μM可以在大多數(shù)體系中獲得良好的擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增效率不高時，可增加
PCR反應(yīng)體系中的引物濃度；發(fā)生非特異擴(kuò)增時，可適當(dāng)減少PCR反應(yīng)體系中的引物濃
度。需要進(jìn)一步優(yōu)化引物濃度的，可以在0.05-0.90 μM范圍內(nèi)調(diào)整。
*2 幾種常見儀器的匹配ROX Reference Dye濃度見下表：
儀器 終濃度
ABI 5700/7000/7300/7700/7900HT/StepOneTM/
StepOne PlusTM
5×(例如：5 μl ROX/50 μl體系)
ABI 7500、7500 Fast、ViiA 7、QuantStudio 、
12K Flex；Agilent Mx3000P、Mx3005P和Mx4000 1×(例如：1 μl ROX/50 μl體系)
Roche儀器，Bio-Rad儀器，Eppendorf儀器等 不用添加
3. 進(jìn)行Real Time One Step RT-qPCR反應(yīng)
PCR反應(yīng)管請用離心機瞬時離心后放入熒光定量PCR儀中進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)。建
議采用下列圖表顯示的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)程序，如果使用該程序得不到良好的實驗結(jié)果時，再進(jìn)
行PCR條件的優(yōu)化。
1. 完全融化模板RNA，特異性引物，2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green)，
50×ROX Reference Dye和RNase-Free ddH2O，短暫離心后置于冰浴上。
2. 按下表在冰浴條件下配制反應(yīng)液：
組成成分 體積／反應(yīng)
2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green) 25 μl
25×RT-PCR Enzyme Mix 2 μl
上游特異性引物(10 μM) 1.25 μl*1
下游特異性引物(10 μM) 1.25 μl*1
RNA模板 10 pg-1 μg total RNA
50×ROX Reference Dye*2 根據(jù)不同儀器添加
RNase-Free ddH2O 補水至50 μl
總體系 50 μl
*1 引物終濃度為0.25 μM可以在大多數(shù)體系中獲得良好的擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增效率不高時，可增加
PCR反應(yīng)體系中的引物濃度；發(fā)生非特異擴(kuò)增時，可適當(dāng)減少PCR反應(yīng)體系中的引物濃
度。需要進(jìn)一步優(yōu)化引物濃度的，可以在0.05-0.90 μM范圍內(nèi)調(diào)整。
*2 幾種常見儀器的匹配ROX Reference Dye濃度見下表：
儀器 終濃度
ABI 5700/7000/7300/7700/7900HT/StepOneTM/
StepOne PlusTM
5×(例如：5 μl ROX/50 μl體系)
ABI 7500、7500 Fast、ViiA 7、QuantStudio 、
12K Flex；Agilent Mx3000P、Mx3005P和Mx4000 1×(例如：1 μl ROX/50 μl體系)
Roche儀器，Bio-Rad儀器，Eppendorf儀器等 不用添加
3. 進(jìn)行Real Time One Step RT-qPCR反應(yīng)
PCR反應(yīng)管請用離心機瞬時離心后放入熒光定量PCR儀中進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)。建
議采用下列圖表顯示的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)程序，如果使用該程序得不到良好的實驗結(jié)果時，再進(jìn)
行PCR條件的優(yōu)化。
注意事項
1. RNA 模板可以采用總RNA 或mRNA，建議使用TIANGEN公司生產(chǎn)的TRNzol，RNAprep
Pure或RNA Easy Fast系列制備高質(zhì)量的總RNA。
2. 一步法RT-qPCR實驗應(yīng)避免RNase污染，可采用以下措施：
1） 因人的皮膚表面和唾液都有RNase，因此實驗中應(yīng)佩戴一次性手套和口罩；
2） 一步法RT-qPCR實驗應(yīng)使用專門的儀器和耗材，建議在專門區(qū)域操作RNA；
3） 一步法RT-qPCR實驗相關(guān)耗材應(yīng)用0.1％ DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃
處理12 h，并高壓滅菌30 min后使用。
3. 25×RT-PCR Enzyme Mix在取用之前應(yīng)短暫離心收集溶液后再吸取，吸取時動作要慢，
使用后應(yīng)盡快放回-20℃。
4. 2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green)在取用前應(yīng)充分混勻并離心后使用。