甲基化檢測
幾個概念：
1，CpG島：富含CpG二核苷酸的一些區(qū)域，長度為300—3000bp。這里CpG是胞嘧啶（C）—磷酸（p）—鳥嘌呤（G）的縮寫。甲基化發(fā)生的重點基因區(qū)段。
2，甲基化率：指樣本對應位點發(fā)生甲基化的概率。
3，甲基化處理：通過重亞硫酸鹽處理將所有未甲基化的胞嘧啶(c)轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(u)，甲基化胞嘧啶在這個過程中保持不變。
4：轉(zhuǎn)化率：甲基化處理后，三個未甲基化的內(nèi)對照區(qū)段中檢測到的胸腺嘧啶（T）數(shù)量與陽性標準品中胞嘧啶（C）的數(shù)量的比值。
幾種甲基化檢測方法：
1，Qpcr方法：通過熒光標記的目的序列，檢測單個位點是否發(fā)生甲基化。
優(yōu)缺點：引物設計要求高，需要加入3個QC組監(jiān)測DNA量和完整性以及轉(zhuǎn)化回收率和轉(zhuǎn)化完整率。成本高。C經(jīng)過處理后所占比例大大減少，引物和目的基因的結合穩(wěn)定性大大降低。
2，一代+單克隆方法：通過一代sanger測序法，對甲基化處理后的DN**段進行測序。甲基化的樣本和未甲基化的樣本產(chǎn)生2個重疊峰，通過判斷重疊峰和主峰的峰高比值計算甲基化率。
優(yōu)缺點：統(tǒng)計樣本的甲基化率時，需要對多個樣本進行測序，成本大。甲基化率的判讀復雜，容易受雜峰影響，比率計算不精確。通過單克隆篩選的方法可以解決該問題，帶來的新的問題就是單克隆培養(yǎng)的周期時間和成本。
3，焦磷酸測序：引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase).熒光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。
優(yōu)缺點：精確性高，可重復性好，檢測速度較快，靈活性好。適用于已知的短序列的測序分析，改良后也可進行高通量測序，唯一的缺點，成本特高。
4，二代NGS測序+多重PCR：本公司解決方案，重亞硫酸鹽處理后，通過自己開發(fā)的多重PCR技術，在同一管內(nèi)進行多個PCR反應，降低所需DNA樣本量，節(jié)約成本。二代NGS測序，解決多個樣本的甲基化率檢測問題，測序深度達到1000×，成本更低，測序精確性更好。使用國外進口QIAGEN凱杰試劑盒，保障樣本處理的效果。15年的科研經(jīng)驗，不斷優(yōu)化實驗體系，確保甲基化轉(zhuǎn)化率達到99％，檢出率達到95％。
優(yōu)缺點:成本特低，測序精度高，檢出率高，精確計算統(tǒng)計多個樣本的甲基化率。唯一缺點，實驗周期較長。適合多樣本，多位點檢測。
歡迎相關研究的老師前來交流