期刊：Nature communications影響因子：14.7
主要技術(shù)：scRNAseq ，CITE-Seq
導(dǎo)語(yǔ)
巨噬細(xì)胞存在于每個(gè)組織中，在組織穩(wěn)態(tài)以及協(xié)調(diào)免疫系統(tǒng)對(duì)病原體和組織損傷的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞是極其多樣化的，具有不同的個(gè)體發(fā)育，組織特異性表型，以及在炎癥和修復(fù)中的不同功能。雖然最初被認(rèn)為來(lái)源于血液?jiǎn)魏思?xì)胞，但現(xiàn)在已知一些組織特異性的駐留巨噬細(xì)胞，例如小膠質(zhì)細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和Langerhans細(xì)胞是胚胎來(lái)源的，并在一生中自我補(bǔ)充。最近的研究表明，許多器官中存在額外的組織巨噬細(xì)胞，這些巨噬細(xì)胞可大致分為2個(gè)或3個(gè)不同的亞群。雖然不同組織巨噬細(xì)胞亞群的確切功能尚不完全清楚，但它們與促進(jìn)組織炎癥、組織修復(fù)和組織纖維化等異常反應(yīng)有關(guān)。在肺內(nèi)，經(jīng)典的組織定居巨噬細(xì)胞為肺泡巨噬細(xì)胞，定居于肺泡腔內(nèi)。在肺實(shí)質(zhì)內(nèi)，可以在血管系統(tǒng)和大氣道附近以及肺泡壁的間質(zhì)中發(fā)現(xiàn)一種額外的組織巨噬細(xì)胞，稱為間質(zhì)巨噬細(xì)胞( Interstitial macrophage，IM )，IM可以分為兩個(gè)或三個(gè)亞群，Notch通路在包括髓系細(xì)胞在內(nèi)的許多系統(tǒng)的細(xì)胞分化中起著至關(guān)重要的作用。Notch受體有4種，Notch1-4，分別與5種不同的配體Jag1，2，Dll1，3，4相互作用。在髓系細(xì)胞中，已知Notch2信號(hào)對(duì)Esam + 2型傳統(tǒng)樹(shù)突狀細(xì)胞( c DC2 )的發(fā)育和Ly6Chi經(jīng)典單核細(xì)胞向巡游單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。在脾臟和心臟中，這種轉(zhuǎn)換也抑制了單核細(xì)胞向組織的募集和隨后的巨噬細(xì)胞分化。
主要技術(shù)
scRNAseq ，CITE-Seq
研究結(jié)果
1. 抑制Notch2可增加肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞的數(shù)量
Notch2是肺內(nèi)杯狀細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和炎性ILC2s形成所必需的。為了證實(shí)IMs的擴(kuò)增是細(xì)胞固有的，而不是繼發(fā)于其他細(xì)胞中的Notch2信號(hào)，我們產(chǎn)生了骨髓嵌合體，允許在造血或非造血隔室(圖1e , f)中誘導(dǎo)Notch2的缺失。只有在骨髓供體細(xì)胞中敲除Notch2時(shí)，Notch2的缺失才會(huì)增加IMs的數(shù)量，提示Notch2對(duì)IMs的影響是造血室固有的(圖1e )。為了證實(shí)Notch2阻斷的效應(yīng)是巨噬細(xì)胞譜系固有的，我們?cè)u(píng)估了混合骨髓嵌合體中的IM數(shù)量。將WT小鼠的骨髓與對(duì)照小鼠的骨髓按1：1的比例混合，同系標(biāo)記用于追蹤髓系細(xì)胞的起源(圖1g )。處理后只有Notch2缺失的骨髓來(lái)源的IMs在肺中的數(shù)量增加(圖1g )。因此，Notch2阻斷內(nèi)在地作用于單核/巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞，以擴(kuò)大肺中的IM數(shù)量。
圖 1
2. 單細(xì)胞分析IMs在穩(wěn)定狀態(tài)和Notch2阻斷后的情況
進(jìn)行聚類分析以識(shí)別不同的亞群，揭示了4個(gè)單核細(xì)胞簇( M1、M2、M3、M4)，3個(gè)AM簇( A1、A2、A3)和4個(gè)IM簇( I1、I2、I3、I4) (圖2a )。簇M4，A2和I4主要存在于α Notch2處理的小鼠中，而M2僅存在于對(duì)照抗體處理的小鼠(圖2a , b)中。有趣的是，M4群體位于單核細(xì)胞和突現(xiàn)簇I4之間的UMAP，表明M4可能代表中間群體(圖2a )。Notch2阻斷也誘導(dǎo)AMs表型由A1型向A2型轉(zhuǎn)變。A2型AMs的特征是AM身份關(guān)鍵標(biāo)記基因Car4表達(dá)量較高，為32，但RNA和抗體標(biāo)記(圖2c ,補(bǔ)充圖2f)的AM標(biāo)記Siglec F水平相似。在兩種條件下都存在的較小種群A3被鑒定為增殖型AMs (圖2c ,附圖2e)。最后，對(duì)照組小鼠中幾乎所有的IMs分離成I1，I2和I3簇。Cluster I1表達(dá)Lyve1、Folr2、Mrc1、CD163和CD209f (圖2c )。與此相反，IP α Notch2處理的動(dòng)物中超過(guò)80 %的IMs由cluster ( I4 ) (圖2a , b)表示。該群體表達(dá)一些選擇性激活相關(guān)基因，如Arg1和Chil3，以及Spp1，F(xiàn)abp5，Gpnmb，S100a6和多個(gè)組織蛋白酶( Ctsb、Ctsd、Ctsk、Ctss) (圖2c )。有趣的是，A2和M4群體也表達(dá)了一些標(biāo)記，但程度較輕。這些基因均未在穩(wěn)態(tài)IMs (附圖2e)中高表達(dá)。
圖 2
3. 單核源性的α Notch2擴(kuò)大間質(zhì)巨噬細(xì)胞數(shù)量
通過(guò)阻斷Notch2誘導(dǎo)M4群，并將其定位在單核細(xì)胞和IMs之間的UMAP中，提示I4群來(lái)源于單核細(xì)胞。M4細(xì)胞通過(guò)我們的FACS和使用Immgen數(shù)據(jù)庫(kù)均被鑒定為單核細(xì)胞，但沒(méi)有用用于標(biāo)記血管內(nèi)細(xì)胞的α CD45 - APC抗體進(jìn)行標(biāo)記(圖3a )。在對(duì)照小鼠中，我們沒(méi)有鑒定出三種主要細(xì)胞類型( IM、AM、單核細(xì)胞,圖3b ,附圖3b)之間的任何細(xì)胞轉(zhuǎn)換，這表明AMs和IMs是相對(duì)穩(wěn)定的群體，單核細(xì)胞的任何潛在替代是一個(gè)罕見(jiàn)和/或緩慢的過(guò)程。然而，在Notch2阻斷后，我們很容易識(shí)別單核細(xì)胞和擴(kuò)增的α Notch2衍生的IM cluster I4之間的細(xì)胞轉(zhuǎn)換，而不是從AMs (圖3b )。
圖 3
4. 局部阻斷Notch2可誘導(dǎo)具有肺泡巨噬細(xì)胞樣表型的I4型巨噬細(xì)胞
為了區(qū)分外周阻斷Notch2對(duì)骨髓造血和肺內(nèi)細(xì)胞的影響，我們?cè)诘?天和第7天通過(guò)被動(dòng)氣管內(nèi)吸入( IT )直接將抗體注入氣道，并在第14天使用sc RNAseq 評(píng)估肺巨噬細(xì)胞。在對(duì)照IT處理的小鼠中，我們檢測(cè)到I4巨噬細(xì)胞數(shù)量的適度增加，這可能反映了對(duì)液體應(yīng)用于肺的反應(yīng)。相反，用α Notch2抗體IT處理增加了IMs的總數(shù)，大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)相同的I4標(biāo)記基因( Spp1、Gpnmb、Fabp5、Cd9和Arg1)(圖4a - c )，為了更好地了解組成I4群體的特征，我們使用基于圖的方法Hotspot37分析了特定的I4轉(zhuǎn)錄程序，該方法基于局部自相關(guān)和鄰近細(xì)胞之間的共表達(dá)將基因組織成模塊。為此，如前所述，將兩個(gè)數(shù)據(jù)集( IT、IP)整合在一起，并使用IT / IP Notch2阻斷的聯(lián)合數(shù)據(jù)集(圖5a - c )進(jìn)行熱點(diǎn)分析。這使得我們能夠評(píng)估一個(gè)簇內(nèi)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，并捕獲不會(huì)自然分離到不同子簇的基因表達(dá)梯度。通過(guò)AM標(biāo)記基因Ear2，Plet1，Wfdc21和Ltc4s的表達(dá)來(lái)定義模塊I4d (圖5a )。I4d信號(hào)在AMs ( A1-A3 )中最高，但也存在于IT誘導(dǎo)的I4細(xì)胞中，而不是IP阻斷劑(圖5b , c )誘導(dǎo)的I4細(xì)胞。事實(shí)上，更多的AM特異性模塊I4d僅在與A2 AMs聚類最近的" AM-like " I4巨噬細(xì)胞中表達(dá)，進(jìn)一步表明在IT而不是IP處理的小鼠(圖5c)中AMs和I4巨噬細(xì)胞之間的潛在關(guān)系。
圖 4
圖 5
5. 在器官損傷模型中，抗Notch2誘導(dǎo)的IMs類似于巨噬細(xì)胞狀態(tài)
從器官損傷數(shù)據(jù)集中對(duì)穩(wěn)態(tài)IMs以及各自的未處理對(duì)照進(jìn)行分類，結(jié)果表明這些研究中的絕大多數(shù)細(xì)胞可以被注釋為屬于簇I1，I2和I3。一小部分細(xì)胞可以歸類為I4，這表明I4巨噬細(xì)胞是穩(wěn)定狀態(tài)(圖6a , b和圖2b)中一個(gè)真實(shí)但罕見(jiàn)的群體。組織損傷的公開(kāi)數(shù)據(jù)集來(lái)自7個(gè)不同的研究，主要集中在不同的器官：肝臟41個(gè)，脂肪組織38個(gè)，骨骼肌42個(gè)，心臟43個(gè)，肺27個(gè)，44個(gè)，45個(gè)。在高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠的附睪脂肪墊和肝臟中0.7 %和15 %的巨噬細(xì)胞被分類為I4型巨噬細(xì)胞(圖6b )。在小鼠器官損傷模型中，包括梗死的心臟，創(chuàng)傷性肌肉損傷和幾種不同的肺纖維化模型中，15-70 %的間質(zhì)巨噬細(xì)胞可以分類為I4細(xì)胞(圖6b )。我們將這些研究的IMs與IP或IT α Notch2的IMs進(jìn)行比較，通過(guò)計(jì)算相似度得分，將所有研究整合在相同的PCA空間(附圖6a , b)中。與insult條件相關(guān)的IM細(xì)胞與Notch2阻斷后的IM具有較高的相似性(圖6c )。在I4群體中，在組織損傷小鼠模型中鑒定的I4巨噬細(xì)胞比在對(duì)照小鼠(附圖6c)中鑒定的I4細(xì)胞更類似于α Notch2誘導(dǎo)的I4細(xì)胞。有趣的是，在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的時(shí)間進(jìn)程研究中發(fā)現(xiàn)，在給藥后45天，類似I4型巨噬細(xì)胞的細(xì)胞持續(xù)擴(kuò)增(圖6d )。為了確定Notch信號(hào)在損傷后是否可能被調(diào)節(jié)，我們使用Cell ChatDB分析了在對(duì)照動(dòng)物和博來(lái)霉素?fù)p傷后收集的全肺數(shù)據(jù)中的Notch受體- Notch配體相互作用。這一分析表明，在博來(lái)霉素作用后的IM簇中，Notch - Notch配體相互作用減弱(圖6f )。Notch相互作用的喪失與I4巨噬細(xì)胞的出現(xiàn)相吻合，并支持在組織損傷和炎癥期間體內(nèi)Notch信號(hào)的喪失可能作為信號(hào)促進(jìn)I4細(xì)胞狀態(tài)的觀點(diǎn)。
圖 6
結(jié)語(yǔ)
本研究發(fā)現(xiàn)Notch2信號(hào)阻斷能夠誘導(dǎo)肺部I4型巨噬細(xì)胞的增加，這些細(xì)胞在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺損傷和SARS-CoV-2感染模型中顯示出抗炎和抗纖維化的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，I4巨噬細(xì)胞并非纖維化的驅(qū)動(dòng)因素，反而可能在減輕肺部纖維化和炎癥中發(fā)揮保護(hù)作用，在過(guò)去幾年中，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法的迅速采用為疾病的發(fā)病機(jī)制提供了深刻的見(jiàn)解，揭示了新的細(xì)胞狀態(tài)，如在非適應(yīng)性組織反應(yīng)中存在的巨噬細(xì)胞。將這種細(xì)胞狀態(tài)與病理反應(yīng)的進(jìn)展聯(lián)系起來(lái)是很有誘惑力的，我們的結(jié)果表明，在許多器官損傷和人類疾病模型中看到的I4巨噬細(xì)胞本身并不是促纖維化的，甚至可能是保護(hù)性的。需要更精確的遺傳工具和方法來(lái)剖析單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)在疾病中的作用。
參考文獻(xiàn)：
Cruz Tleugabulova M, Melo SP, Wong A, Arlantico A, Liu M, Webster JD, Lau J, Lechner A, Corak B, Hodgins JJ, Garlapati VS, De Simone M, Korin B, Avraham S, Lund J, Jeet S, Reiss A, Bender H, Austin CD, Darmanis S, Modrusan Z, Brightbill H, Durinck S, Diamond MS, Schneider C, Shaw AS, Nitschké M. Induction of a distinct macrophage population and protection from lung injury and fibrosis by Notch2 blockade. Nat Commun. 2024 Nov 6;15(1):9575. doi: 10.1038/s41467-024-53700-9. PMID: 39505846; PMCID: PMC11541919.