有機(jī)構(gòu)預(yù)計(jì)，細(xì)胞治療技術(shù)在未來二十年將進(jìn)入快速成長期，為數(shù)百萬患者帶來治愈期望，而每年產(chǎn)值將可達(dá)數(shù)十億美元。為滿足高速增長的市場(chǎng)需求，已有多家制藥企業(yè)或設(shè)備供應(yīng)商對(duì)治療性細(xì)胞上游生產(chǎn)技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行了全方位的革新和多技術(shù)的整合，隨著這些上游技術(shù)的成熟，每批次細(xì)胞產(chǎn)量預(yù)計(jì)將會(huì)達(dá)到數(shù)千至數(shù)萬億。
細(xì)胞數(shù)量的增加也意味著收獲體積的增加，即從目前的數(shù)十升到未來100L，甚至可能達(dá)1,000L，如此大體積的細(xì)胞收獲液需要濃縮、漂洗、制劑并低溫儲(chǔ)存、灌裝及凍存，這對(duì)目前的下游工藝技術(shù)（DSP）來講，會(huì)是不小的負(fù)擔(dān)，而每個(gè)操作單元微小的變化都有可能顯著影響產(chǎn)品的質(zhì)量和收率，特別是高濃度的產(chǎn)品，下游工藝的選擇和優(yōu)化至關(guān)重要。
治療性細(xì)胞生產(chǎn)目前及今后可能面臨的問題與單克隆抗體（MAb）相似。在90年代中期，單克隆抗體（MAb）的生產(chǎn)滴度降低（~100mg/L），DSP可達(dá)到較高的回收率和極低的產(chǎn)物損失，從而降低生產(chǎn)成本。而當(dāng)生物反應(yīng)器的mAb生產(chǎn)水平增加到了10g/L以上，DSP的局限性開始顯現(xiàn)出來。而治療性細(xì)胞生產(chǎn)批次的大小也會(huì)隨著市場(chǎng)需求的增加的提高，DSP定會(huì)經(jīng)歷相似的瓶頸，故而必需探尋新的、可放大DSP技術(shù)。
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細(xì)胞治療產(chǎn)品及工藝要求
任何技術(shù)都必需為產(chǎn)品服務(wù)，所以要對(duì)DSP進(jìn)行優(yōu)化升級(jí)，必需先了解治療性細(xì)胞的產(chǎn)品要求。一般情況下，細(xì)胞治療產(chǎn)品用于臨床給藥時(shí)，其可接受的最低濃度為70%（理想為>85%），而臨床醫(yī)生在理想的操作下可回收>80%的活細(xì)胞。要達(dá)到如此高的活性，必需對(duì)細(xì)胞收獲后每一步下游操作中細(xì)胞活性的降低情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)和控制。此外，還需考慮濃縮和漂洗等工藝的時(shí)間性問題，因?yàn)橐话阋蠹?xì)胞在收獲的同一天進(jìn)入冷藏保存，這樣才能最大限度地保證細(xì)胞的健康。
其它要求還包括可達(dá)到較寬的細(xì)胞濃度范圍（1x108-109cells/ml）和極高的殘留物清除水平，這就意味著DSP系統(tǒng)的工作體積應(yīng)盡量低，并能達(dá)到較高的濃縮因子（Cf），且可保持細(xì)胞懸浮，以有效清洗。當(dāng)進(jìn)入后期臨床或商業(yè)化生產(chǎn)，需對(duì)DSP進(jìn)行放大時(shí)，可使用特定的過程分析技術(shù)（PAT），進(jìn)行實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)采集，實(shí)現(xiàn)連續(xù)工藝監(jiān)測(cè)，方便決策和產(chǎn)品質(zhì)量控制。此外，出于商業(yè)利潤考慮，大規(guī)模生產(chǎn)更傾向于使用封閉系統(tǒng)，以將因污染導(dǎo)致的批次失敗風(fēng)險(xiǎn)降至最小。
在治療性細(xì)胞生產(chǎn)中，細(xì)胞濃縮和漂洗通常在收獲后立即進(jìn)行。從上游工藝收獲的細(xì)胞一般會(huì)被濃縮40倍以上，再以純化緩沖液進(jìn)行漂洗，以減低殘留物的水平，如血清和胰蛋白酶。制劑并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，確保每劑終產(chǎn)品含有特定數(shù)量的細(xì)胞，最后灌裝凍存。整個(gè)工藝的每個(gè)操作單元都有特定的工藝要求，而整體上又取決于總收獲量、目標(biāo)細(xì)胞濃度以及每批次總生產(chǎn)劑量。
在可放大的培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行治療性細(xì)胞的擴(kuò)增和收獲需注意工藝的調(diào)節(jié)，包括降低污染風(fēng)險(xiǎn)、防止產(chǎn)品降解以及維持產(chǎn)品功能。細(xì)胞治療產(chǎn)品的純度必須極高，因其由人源細(xì)胞組成，并用于植入患者體內(nèi)，所以必須符合特定的治療性標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞治療產(chǎn)品用于臨床給藥時(shí)，需高于特定的最低活細(xì)胞數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)降低非活性細(xì)胞的比例（<20%）。
此外，細(xì)胞治療產(chǎn)品一般要求高細(xì)胞濃度，低給藥體積。所以，細(xì)胞治療DSP的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是處理大體積的細(xì)胞懸液（100-1,000L），達(dá)到極高的細(xì)胞濃度和純度水平，以便凍存及給藥，同時(shí)保持每批次產(chǎn)品“準(zhǔn)確”的一致性。目前用于臨床試驗(yàn)的細(xì)胞治療產(chǎn)品濃度往往會(huì)有差異，且每劑量的灌裝體積都會(huì)有所不同。標(biāo)準(zhǔn)的差異性會(huì)顯著影響DSP流程，但先決條件是，濃縮步驟需達(dá)到極高的細(xì)胞密度，通常>25 x 107 cells/mL，某些情況下≤100 x 107 cells/mL，且即使在大規(guī)模生產(chǎn)條件下，也需使產(chǎn)品損失或質(zhì)量變化最小化。
治療性細(xì)胞產(chǎn)品還應(yīng)符合特定的終產(chǎn)品一致性、效力和純度，而最重要的是，必需安全。由于治療性細(xì)胞不能進(jìn)行終滅菌（除菌過濾或輻照滅菌），DSP過程必需消除外源性污染物。使用封閉處理系統(tǒng)可降低外源性污染的風(fēng)險(xiǎn)，而可拋棄性產(chǎn)品的使用有助于消除與其它批次間交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。將單次使用技術(shù)與常規(guī)DSP操作進(jìn)行整合，可顯著降低甚至消除污染。此外，單次使用技術(shù)也可節(jié)省時(shí)間，降低產(chǎn)品總成本（CoGs）。
工藝規(guī)模放大的另一個(gè)挑戰(zhàn)是細(xì)胞漂洗，去除各步工藝殘留物及雜質(zhì)。按FDA對(duì)用于細(xì)胞治療的生物產(chǎn)品的要求，此類產(chǎn)品“如在細(xì)胞培養(yǎng)的任何階段使用了血清，其在終產(chǎn)品中的計(jì)算濃度不得超過1:1,000,000”。所以在DSP中，必須有效清除的殘留血清，使終血清濃度良好符合監(jiān)管部門的預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)。且在生產(chǎn)工藝設(shè)計(jì)時(shí)，需注意控制細(xì)胞的漂洗體積，以降低工藝時(shí)間，使細(xì)胞在整個(gè)過程中保持懸浮，理想狀況下呈分散的單個(gè)細(xì)胞。這樣，雜質(zhì)就不會(huì)被“困在”細(xì)胞之間或不可逆地黏附在細(xì)胞上。而DSP系統(tǒng)需能有效避免死腔存在，這些區(qū)域會(huì)截留雜質(zhì)，導(dǎo)致其進(jìn)入終產(chǎn)品中。
技術(shù)簡(jiǎn)介
傳統(tǒng)的濃縮和澄清工藝主要使用離心方法，包括小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室開放式離心以及較大規(guī)模的封閉式批量離心。離心的缺陷在于操作繁瑣，污染風(fēng)險(xiǎn)大，且當(dāng)待處理量較大時(shí)，需進(jìn)行多輪次的反復(fù)操作，不僅耗時(shí)較長，成本也隨之提高。
也有公司將臨床血液處理設(shè)備運(yùn)用到細(xì)胞治療領(lǐng)域，該類設(shè)備大多采用了一次性料液袋技術(shù)，可顯著降低工藝污染風(fēng)險(xiǎn)，并實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。但其單次循環(huán)處理量通常低于1L，規(guī)模放大可行性較差。且有些系統(tǒng)只能進(jìn)行濃縮，而無法兼容漂洗步驟。
目前治療性細(xì)胞生產(chǎn)由于上游工藝的限制，最終收獲體積通常不超過20-35L。當(dāng)批次體積增加到商業(yè)生產(chǎn)規(guī)模時(shí)，上游工藝可能可產(chǎn)生100-1,000L的收獲體積，傳統(tǒng)技術(shù)很難再處理如此大的規(guī)模。為避免此類瓶頸出現(xiàn)，使用可放大的DSP勢(shì)在必行，在眾多已經(jīng)試驗(yàn)的方法中，切向流過濾（TFF）技術(shù)被認(rèn)為是最有可能成為未來治療性細(xì)胞生產(chǎn)DSP的主流。
切向流過濾
在常規(guī)過濾中，料液流向與過濾器膜表面垂直，即死端過濾（DFF），DFF常用于除菌過濾及分離亞微粒分子，不適合處理含有大分子及全細(xì)胞的大體積料液。而在切向流過濾（TFF）中，料液沿膜表面切向泵過，過濾器膜兩側(cè)的壓力差（即跨膜壓TMP）驅(qū)動(dòng)滲透性料液通過膜進(jìn)入濾液一側(cè)。平面膜包和中空纖維組件是常用的切向流過濾形式，平面膜包通常會(huì)產(chǎn)生較高的系統(tǒng)滯留體積，且大規(guī)模處理產(chǎn)品通常沒有即用型的預(yù)滅菌形式，而細(xì)胞治療行業(yè)通常要求低系統(tǒng)滯留體積和可拋棄性使用。
中空纖維切向流過濾已成功應(yīng)用于上千升細(xì)胞培養(yǎng)收獲液的蛋白處理工藝，但在蛋白澄清操作中通常使用較高的TMP，而在治療性細(xì)胞處理中，為保持較高的細(xì)胞活性及生物功能，需保持較低的剪切率和TMP，才能在達(dá)到高細(xì)胞濃度（60-100倍）和高回收率（>90%）的同時(shí)，維持高細(xì)胞活性（>90%）。此外，在漂洗操作中，需注意控制濾液流速，以有效漂洗細(xì)胞，將殘留物濃度降至1ppm以下，同時(shí)縮短工藝時(shí)間。
在大規(guī)模治療性細(xì)胞生產(chǎn)中，系統(tǒng)可整合單次使用型壓力傳感器，以監(jiān)測(cè)關(guān)鍵的工藝變量，如濾液壓力及TMP。為精確測(cè)量液體流速，還可使用非侵入式流量傳感器。可拋棄型傳感器的使用將極大地增強(qiáng)過程分析技術(shù)在下游操作中的執(zhí)行，從而支持質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）方法。
仕必純提供一體式設(shè)計(jì)的自動(dòng)化TFF系統(tǒng)，系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于蛋白藥物的生產(chǎn)，只需稍作調(diào)整，即可滿足治療性細(xì)胞生產(chǎn)中細(xì)胞產(chǎn)品的特殊要求。根據(jù)所選過濾器規(guī)格的不同，TFF可滿足較寬的處理量范圍，而且系統(tǒng)工作體積較低，所以，在研發(fā)階段，只需要少量的細(xì)胞原液即可使用系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，從而節(jié)省起步成本。仕必純切向流過濾包括從研發(fā)到中試及生產(chǎn)的一系列系統(tǒng)，從研發(fā)階段獲取的工藝參數(shù)數(shù)據(jù)可直接規(guī)模放大用于中試及生產(chǎn)系統(tǒng)，維持工藝的一致性，從而確保產(chǎn)品質(zhì)量。
而且，仕必純將切向流過濾與可拋棄型使用技術(shù)進(jìn)行了完美的整合，推出了獨(dú)特的MBT流體處理系統(tǒng)，即將中空纖維過濾器與料液袋及管路進(jìn)行預(yù)組裝和整體滅菌，形成完整的封閉工藝系統(tǒng)，既省去了DSP中流路構(gòu)建和清洗的時(shí)間，又有效避免了污染的風(fēng)險(xiǎn)。MBT可根據(jù)實(shí)際處理量及工藝流程進(jìn)行定制化設(shè)計(jì)，以最大限度地滿足應(yīng)用需求。
展望
隨著治療性細(xì)胞每批次生產(chǎn)規(guī)模的提高和上游技術(shù)的成熟，下游工藝瓶頸逐漸顯現(xiàn)，特別是濃縮和漂洗操作。為滿足終產(chǎn)品質(zhì)量要求，DSP平臺(tái)應(yīng)盡可能靈活、高效、經(jīng)濟(jì)。DSP需能處理含有數(shù)千萬至上億細(xì)胞的細(xì)胞懸液，同時(shí)達(dá)到較高的濃縮因子、產(chǎn)品純度并縮短處理時(shí)間。
TFF作為最新優(yōu)化的技術(shù)，具有良好的可放大性，同時(shí)單批次可濃縮并漂洗100-1,000L的細(xì)胞懸液。仕必純TFF技術(shù)整合了單次使用傳感器，用于連續(xù)實(shí)時(shí)工藝監(jiān)測(cè)，系統(tǒng)可靈活地處理不同規(guī)模的細(xì)胞收獲液，規(guī)模放大簡(jiǎn)單，降低設(shè)備及操作成本。TFF極有可能成為細(xì)胞治療DSP的主要技術(shù)。