期刊：Nature Neuroscience
影響因子：21.2
伯優(yōu)試劑產(chǎn)品：伯優(yōu)®細(xì)胞核分離試劑盒（52009-10）
研究背景
漸凍癥（肌萎縮側(cè)索硬化癥，ALS）是一種神經(jīng)退行性疾病，表現(xiàn)為進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（MN）丟失和肌肉萎縮。這種疾病分為家族性（fALS）和散發(fā)性（sALS），其中散發(fā)性ALS占所有病例的90%左右。盡管科學(xué)家們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多與家族性ALS相關(guān)的基因突變，但散發(fā)性ALS的發(fā)病機(jī)制仍然知之甚少。近年研究發(fā)現(xiàn)，近半數(shù)sALS患者存在線粒體呼吸鏈復(fù)合體IV（CIV）的功能缺陷，但這一現(xiàn)象是否直接導(dǎo)致ALS尚缺乏直接證據(jù)。
研究目的
本研究旨在探討線粒體呼吸鏈復(fù)合體IV（CIV）缺陷在散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化癥（sALS）中的作用。通過在大鼠神經(jīng)元中引入CIV亞基突變，研究發(fā)現(xiàn)CIV缺陷足以引發(fā)ALS樣表型，包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元選擇性丟失和癱瘓，從而揭示CIV缺陷可能是sALS的潛在病因，并為其治療提供新方向。
伯優(yōu)試劑產(chǎn)品
伯優(yōu)®細(xì)胞核分離試劑盒（52009-10）
研究結(jié)果
1. sALS 患者普遍存在 CIV 缺陷
研究團(tuán)隊(duì)收集了40例sALS患者的血液樣本，發(fā)現(xiàn)50%的患者存在mtDNA突變（如COXI基因6692A缺失），導(dǎo)致CIV關(guān)鍵亞基翻譯提前終止。此外，對(duì)29例sALS患者的肌肉活檢發(fā)現(xiàn)，部分患者肌肉中存在COX缺陷纖維，且運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（MN）中CIV亞基表達(dá)顯著降低。通過將329名ALS患者運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的RNA測(cè)序（RNA-seq）數(shù)據(jù)與他們的生存時(shí)間進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，CIV低表達(dá)的ALS患者生存期更短。
利用線粒體基因組編輯技術(shù)（DdCBE），研究團(tuán)隊(duì)在大鼠神經(jīng)元中特異性敲除CIV亞基（COXII/III），成功構(gòu)建了首個(gè)模擬sALS的動(dòng)物模型。這些大鼠逐漸出現(xiàn)體重減輕、骨骼肌萎縮、后凸和癱瘓等ALS樣表型。
研究人員對(duì)出生后3周、1個(gè)月和2個(gè)月的COXIIINeuN-Cre大鼠與COXIIILSL對(duì)照組之間進(jìn)行了多項(xiàng)運(yùn)動(dòng)行為測(cè)試，這些大鼠出現(xiàn)漸進(jìn)性運(yùn)動(dòng)缺陷的發(fā)展類似于人類ALS癥狀的進(jìn)展。因此，CIV的神經(jīng)元缺陷導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)多種類似ALS的表型。
3. CIV缺陷大鼠的選擇性MN丟失
鑒于嚴(yán)重的后肢運(yùn)動(dòng)缺陷是經(jīng)典ALS表型特征，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)CIV缺陷大鼠腰椎脊髓α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異性減少，而γ運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元未受影響。同時(shí)，通過免疫熒光染色可以觀察到運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（αMNs）的顯著減少，而其他類型的神經(jīng)元?jiǎng)t相對(duì)正常。這些數(shù)據(jù)表明，在這些神經(jīng)元CIV受損的大鼠中，即使在不同亞型的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元之間也存在選擇性易損性。
4. 去神經(jīng)支配和骨骼肌萎縮
ALS的另一個(gè)標(biāo)志是肌肉萎縮，研究者評(píng)估了模型大鼠的脛前肌和腓腸肌。在疾病晚期，模型大鼠的脛前肌和腓腸肌的重量明顯低于其野生型（WT）對(duì)照。通過Wheat Germ Agglutinin（WGA）染色可以觀察到肌肉纖維的萎縮，肌纖維的平均截面積顯著減小。
此外，神經(jīng)肌肉接頭（NMJ）的完整性受損，表現(xiàn)為神經(jīng)末梢與肌纖維的連接減少。研究者進(jìn)一步對(duì)脛前肌的神經(jīng)肌肉接點(diǎn)（NMJ）進(jìn)行了深入分析，該肌肉主要由腰椎脊髓中的α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元支配的快縮肌纖維組成，這在人體中對(duì)肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）特別敏感。在對(duì)CIV損傷的反應(yīng)中，NMJ的衰弱表現(xiàn)得非常明顯，NF和突觸素2信號(hào)都明顯減少。對(duì)腓腸肌的電生理記錄顯示，由坐骨神經(jīng)引起的復(fù)合肌肉動(dòng)作電位（CMAP）振幅明顯下降。這些數(shù)據(jù)表明在CIV缺陷模型中NMJ的完整性受到損害，這種情況通常出現(xiàn)在ALS患者中。
5. 神經(jīng)炎癥升高和細(xì)胞死亡
為了闡明觀察到的CIV缺陷大鼠中MN損失的機(jī)制，研究者對(duì)COXIII-LSL與COXIII-NeuN-Cre大鼠的腰脊髓前角進(jìn)行了單細(xì)胞核RNA測(cè)序(snRNA-seq)和基因集富集分析（GSEA）。snRNA-seq揭示，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和GSDME依賴性細(xì)胞壞死是MN丟失的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。差異表達(dá)基因（DEGs）主要與四個(gè)通路相關(guān)，包括神經(jīng)炎癥反應(yīng)、鈣離子跨膜運(yùn)輸、神經(jīng)元凋亡過程和與其他神經(jīng)細(xì)胞比較下的α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元突觸可塑性。值得注意的是，被鑒定為脊髓損傷的神經(jīng)元特異性生物標(biāo)志物的ATF3在α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中也被顯著激活，涉及髓鞘抑制和反射遲鈍的基因也均被激活。神經(jīng)元CIV缺乏導(dǎo)致約70%的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在出生后第6周出現(xiàn)TDP-43細(xì)胞質(zhì)錯(cuò)誤定位，伴隨有ATP生產(chǎn)減少。此外，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死的GSDME基因（編碼Gasdermin E蛋白）也被激活。這些數(shù)據(jù)表明，大鼠模型重現(xiàn)了ALS患者的許多關(guān)鍵特征。
關(guān)于本研究中使用的
snRNA-seq研究方法
在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)采用單細(xì)胞核RNA測(cè)序（snRNA-seq）技術(shù)，解析CIV缺陷引發(fā)基因表達(dá)失調(diào)。為了深入探討CIV缺陷對(duì)神經(jīng)元基因表達(dá)的影響，研究團(tuán)隊(duì)使用了伯優(yōu)®細(xì)胞核分離試劑盒（52009-10）。這一試劑盒能夠高效、純凈地分離出神經(jīng)元的細(xì)胞核，為后續(xù)的單細(xì)胞核RNA測(cè)序（snRNA-seq）提供了高質(zhì)量的樣本，確保了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
試劑盒優(yōu)勢(shì)：
·高效分離：我們的試劑盒采用獨(dú)特的配方和密度梯度分離步驟，能夠在保持細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整的同時(shí)，有效去除細(xì)胞質(zhì)和其他雜質(zhì)，從而獲得高純度的細(xì)胞核。
·兼容性強(qiáng)：該試劑盒適用于多種樣本類型，目前已經(jīng)測(cè)試了大量哺乳動(dòng)物組織類型，廣泛滿足不同研究需求。
·高質(zhì)量保證：作為自研產(chǎn)品，我們對(duì)每一批次試劑盒進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，確保每一用戶都能獲得一致的高品質(zhì)體驗(yàn)。
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