產(chǎn)品基本信息
中文名稱：ATTO 488 馬來(lái)酰亞胺
英文名稱：ATTO 488 maleimide
產(chǎn)品貨號(hào)：2816
產(chǎn)品規(guī)格：1 mg
儲(chǔ)存條件：在零下15度以下保存, 避免光照
供應(yīng)商：AAT Bioquest
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ATTO 488 是一種基于羅丹明的熒光標(biāo)記，具有出色的水溶性。它具有強(qiáng)吸收、高熒光量子產(chǎn)率和高光穩(wěn)定性，使其非常適合熒光成像應(yīng)用。
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實(shí)驗(yàn)方案
溶液配制方案
除非另有說(shuō)明，所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成一次性等份，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C。避免反復(fù)凍融循環(huán)。
1.ATTO 488 馬來(lái)酰亞胺儲(chǔ)備溶液（溶液 B） ：
將無(wú)水 DMSO 添加到 ATTO 488 馬來(lái)酰亞胺小瓶中，制成 10 mM 儲(chǔ)備溶液。通過(guò)移液或渦旋充分混合。
注意?????開始綴合前準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液 B）。及時(shí)使用。延長(zhǎng)儲(chǔ)存染料原液可能會(huì)降低染料活性。避光防潮時(shí)，溶液 B 可在冰箱中保存長(zhǎng)達(dá) 4 周。避免凍融循環(huán)。
2. 蛋白原液（A液）
將 100 μL 反應(yīng)緩沖液（例如，pH ~6.0 的 100 mM MES 緩沖液）與 900 μL 目標(biāo)蛋白溶液（例如抗體，蛋白濃度 > 2 mg/mL 如果可能）混合，得到 1 mL 蛋白標(biāo)記庫(kù)存溶液。
注1：蛋白質(zhì)溶液（溶液 A）的 pH 應(yīng)為 6.5 ± 0.5。
注2：不純的抗體、穩(wěn)定的牛血清蛋白（BSA）抗體或明膠不會(huì)被很好的標(biāo)記。疊氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應(yīng)。可以通過(guò)透析或旋轉(zhuǎn)柱除去疊氮化鈉或硫柳汞，以獲得標(biāo)記結(jié)果。
注3：如果蛋白質(zhì)濃度低于 2 mg/mL，結(jié)合效率會(huì)顯著降低。為了獲得最佳標(biāo)記效率，建議最終蛋白質(zhì)濃度范圍為 2-10 mg/mL。
可選：如果您的蛋白質(zhì)不含游離半胱氨酸，則必須用 DTT 或 TCEP 處理蛋白質(zhì)以生成硫醇基團(tuán)。 DTT 或 TCEP 用于將二硫鍵轉(zhuǎn)化為兩個(gè)游離硫醇基團(tuán)。如果使用 DTT，則必須在將馬來(lái)酰亞胺染料與蛋白質(zhì)結(jié)合之前通過(guò)透析或凝膠過(guò)濾除去游離 DTT。以下是生成游離硫醇基團(tuán)的示例方案：
1.在蒸餾水中制備 1 M DTT (15.4 mg/100 μL) 的新鮮溶液。
2.在 20 mM DTT 中制備 IgG 溶液：混合時(shí)每 ml IgG 溶液添加 20 μL DTT 庫(kù)存。在室溫下靜置 30 分鐘，無(wú)需額外混合（以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸）。
3.將還原的 IgG 通過(guò)用“交換緩沖液”預(yù)平衡的過(guò)濾柱。從柱中收集 0.25 mL 餾分。
4.確定蛋白質(zhì)濃度并將大部分 IgG 的級(jí)分合并。這可以通過(guò)分光光度法或比色法來(lái)完成。
5.此步驟后盡快進(jìn)行綴合（請(qǐng)參閱示例實(shí)驗(yàn)方案）。
注意：為了獲得最佳結(jié)果，IgG 溶液應(yīng) >4 mg/mL。如果抗體低于 2 mg/mL，則應(yīng)濃縮。額外包括 10% 的緩沖液交換柱損失。
注意：幾乎可以在 pH 7-7.5 的任何緩沖液中進(jìn)行還原，例如 MES、磷酸鹽或 TRIS 緩沖液。
注意：步驟 3 和 4 可以用透析代替。
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樣品實(shí)驗(yàn)方案：
該標(biāo)記方案是針對(duì)山羊抗小鼠 IgG 與 ATTO 488 馬來(lái)酰亞胺的綴合物而開發(fā)的。請(qǐng)您根據(jù)您的實(shí)際情況，進(jìn)行操作。
注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的特性。蛋白質(zhì)的過(guò)度標(biāo)記可能會(huì)對(duì)其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)綴合物會(huì)降低靈敏度。
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運(yùn)行綴合反應(yīng)：
1.使用 10:1 摩爾比的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白質(zhì)）作為起點(diǎn)：將 5 μL 染料儲(chǔ)備溶液（溶液 B，假設(shè)染料儲(chǔ)備溶液為 10 mM）添加到蛋白質(zhì)小瓶中溶液（95 μL 溶液 A）并有效搖動(dòng)。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為 10 mg/mL，蛋白質(zhì)的分子量為 ~200KD，則蛋白質(zhì)濃度為 ~0.05 mM。
注意：我們建議使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白質(zhì)）摩爾比為 10:1 的溶液。如果太少或太高，則分別確定染料/蛋白質(zhì)比例為 5:1、15:1 和 20:1。
2.繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物30-60分鐘。
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純化綴合：
以下方案是使用 Sephadex G-25 柱純化染料-蛋白質(zhì)綴合物的示例。
1.根據(jù)制造說(shuō)明準(zhǔn)備 Sephadex G-25 柱。
2.將反應(yīng)混合物（來(lái)自“運(yùn)行綴合反應(yīng)”）加載到 Sephadex G-25 柱的頂部。
3.當(dāng)樣品剛好流到頂部樹脂表面下方時(shí)，立即添加 PBS（pH 7.2-7.4）。
4.向所需樣品中添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱純化。合并含有所需染料-蛋白質(zhì)綴合物的級(jí)分。
注意：如需立即使用，染料-蛋白質(zhì)綴合物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。
注意：為了長(zhǎng)期儲(chǔ)存，染料-蛋白質(zhì)綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。