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牛羥脯氨酸(HYP)ELISA試劑盒
?(用于血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其它生物體液內(nèi))
原理
本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心?ABC-ELISA法。用抗牛?HYP?單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的?HYP與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗牛HYP，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，最后加終止液硫酸，在450nm處測(cè)OD值，HYP濃度與OD值成正比，可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中HYP濃度。
試劑盒組成（2-8℃保存）
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酶標(biāo)板（Coated?Wells） |
96孔 |
酶標(biāo)抗體工作液（Enzyme?Conjugate） |
12ml |
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10×標(biāo)本稀釋液（Sample?Buffer） |
12ml |
20×濃縮洗滌液（Wash?Buffer） |
50ml |
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標(biāo)準(zhǔn)品（Standards）：200ug/瓶 |
2瓶 |
底物工作液（TMB?Solution） |
12ml |
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第一抗體工作液（Biotinylated?Antibody） |
12ml |
終止液（Stop?Solution） |
12ml |
準(zhǔn)備試劑與收集血樣
1.?收集標(biāo)本：血清、血漿（EDTA、檸檬酸鹽、肝素抗凝）、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測(cè)，2-8℃保存48小時(shí)；更長(zhǎng)時(shí)間須冷凍（-20?℃或-70?℃）保存，避免反復(fù)凍融。
2.?標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前加入1ml蒸餾水混勻，配成200ug/ml的溶液。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管8管，第一管加標(biāo)本稀釋液900ul，第二至第八管加入標(biāo)本稀釋液500ul。在第一管中加入200ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至第二管。如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對(duì)照。
3.?10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
4.?洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）
檢測(cè)程序
1.?加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100ul，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120分鐘。
2.?洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向?yàn)V紙上印干。
3.?每孔中加入第一抗體工作液100ul。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60分鐘。
4.?洗板：同前。
5.?每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃30分鐘。
6.?洗板：同前。
7.?每孔加入底物工作液100ul，置37?℃暗處反應(yīng)15分鐘。
8.?每孔加入100ul終止液混勻。
9.?30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。
結(jié)果計(jì)算與判斷
1.?所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計(jì)算。
2.?以標(biāo)準(zhǔn)品20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0?ug/ml為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3.?根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)HYP含量。
試劑盒性能
??1.???靈敏度：最小的HYP?檢測(cè)濃度小于0.2ug/ml。
2.?特異性：可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的牛HYP。不與牛其它細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。
3.?重復(fù)性：板內(nèi)、板見(jiàn)變異系數(shù)均小于10％。
注意事項(xiàng)
??1.???以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待測(cè)樣品均建議做復(fù)孔，每次測(cè)定應(yīng)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
?2.???洗滌過(guò)程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致精確度誤差及OD值錯(cuò)誤地升高。
??3.???板條開(kāi)封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。
??4.???本試劑盒宜置4oC冰箱保存。
?5.???本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！