Annexin V-mCherry細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-mCherry Apoptosis Detection Kit)是用紅色熒光蛋白mCherry標(biāo)記的重組人Annexin V來檢測細(xì)胞凋亡時出現(xiàn)在細(xì)胞膜表面的磷酯酰絲氨酸的一種細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。可以使用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。
本試劑盒檢測的是mCherry紅色熒光，mCherry熒光蛋白最大激發(fā)光波長為587nm，最大發(fā)射光波長為610nm。Annexin V-mCherry熒光蛋白的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考圖1。
圖1. Annexin V-mCherry的激發(fā)和發(fā)射光光譜。
Annexin是一類廣泛分布于真核細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷酯結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。但僅Annexin V被報道可以調(diào)控一些PKC的活性。
Annexin V選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱PS)。磷酯酰絲氨酸主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會把磷酯酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。磷酯酰絲氨酸暴露到細(xì)胞表面后會促進(jìn)凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細(xì)胞表面的磷酯酰絲氨酸結(jié)合后可以阻斷磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。
Annexin V-mCherry相比藻紅蛋白(Phycoerythrin, 簡稱PE)標(biāo)記的Annexin V，激發(fā)光譜更窄，不會像PE那樣在495nm左右產(chǎn)生紅色熒光，非常適合與其它綠色熒光一同檢測，在進(jìn)行流式檢測時幾乎不需要進(jìn)行任何補(bǔ)償。
正常細(xì)胞不會被Annexin V-mCherry所染色，凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞都會被Annexin V-mCherry所染色。如果希望進(jìn)一步區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞，可以使用其它細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行檢測。使用本試劑盒檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的效果參考圖2。
圖2. Annexin V-mCherry細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測BGC-823 (人胃癌細(xì)胞)細(xì)胞凋亡和壞死的效果。正常狀態(tài)的BGC-823細(xì)胞在明場下的形態(tài)見圖A；正常細(xì)胞不會被Annexin V-mCherry所染色(圖C-D)。Camptothecin誘導(dǎo)16小時后的BGC-823細(xì)胞在明場下的形態(tài)見圖E；凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜呈紅色熒光(圖G-H)。實(shí)際檢測效果會因?qū)嶒?yàn)條件、檢測儀器的不同而存在差異，本圖僅供參考。本試劑盒中不提供Hoechst 33342，如有需要，可向 Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(100X)。
一個小包裝的本試劑盒C1069S共可以檢測20個樣品，中包裝的試劑盒C1069M可以檢測50個樣品，大包裝的試劑盒C1069L可以檢測100個樣品。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| C1069S-1 | Annexin V-mCherry | 100μl |
| C1069S-2 | Annexin V-mCherry Binding Buffer | 12ml |
| — | 說明書 | 1份 |
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| C1069M-1 | Annexin V-mCherry | 250μl |
| C1069M-2 | Annexin V-mCherry Binding Buffer | 30ml |
| — | 說明書 | 1份 |
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| C1069L-1 | Annexin V-mCherry | 500μl |
| C1069L-2 | Annexin V-mCherry Binding Buffer | 60ml |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，一年有效。Annexin V-mCherry避光保存。
注意事項(xiàng)：
如果有細(xì)菌或真菌污染，會嚴(yán)重影響檢測效果。
染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。
如果細(xì)胞收集過程中使用了胰酶，需注意設(shè)法去除殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-mCherry，最終導(dǎo)致染色失敗。
熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進(jìn)行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。
需自備PBS。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1.對于懸浮細(xì)胞：
a.在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后，1000×g (約1000-2000rpm)離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)。注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時也起到了洗滌細(xì)胞的作用，可以保證后續(xù)Annexin V-mCherry的結(jié)合。
b.取5-10萬重懸的細(xì)胞，1000×g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-mCherry Binding Buffer輕輕重懸細(xì)胞。
c.加入5μl Annexin V-mCherry，輕輕混勻。
d.室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善標(biāo)記效果。
e.隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-mCherry為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測，1000×g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-mCherry Binding Buffer輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。注意：細(xì)胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內(nèi)完成檢測。用于流式細(xì)胞儀檢測時，如果發(fā)現(xiàn)Annexin V-mCherry單獨(dú)染色時出現(xiàn)了過多的其它通道假陽性細(xì)胞，并且通過調(diào)整相關(guān)設(shè)置和參數(shù)也無法改善，可以用PBS將Annexin V-mCherry稀釋3-10倍后再進(jìn)行檢測。
2.對于貼壁細(xì)胞：
a.把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液(可含有EDTA)消化細(xì)胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過度消化。
b.加入步驟2a中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000×g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)。注意：加入步驟2a中的細(xì)胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-mCherry導(dǎo)致染色失敗。
c.取5-10萬重懸的細(xì)胞，1000×g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-mCherry Binding Buffer輕輕重懸細(xì)胞。
d.加入5μl Annexin V-mCherry，輕輕混勻。
e.室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善標(biāo)記效果。
f.隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-mCherry為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測，1000×g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-mCherry Binding Buffer輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。注意：細(xì)胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內(nèi)完成檢測。用于流式細(xì)胞儀檢測時，如果發(fā)現(xiàn)Annexin V-mCherry單獨(dú)染色時出現(xiàn)了過多的其它通道假陽性細(xì)胞，并且通過調(diào)整相關(guān)設(shè)置和參數(shù)也無法改善，可以用PBS將Annexin V-mCherry稀釋3-10倍后再進(jìn)行檢測。
3.對于貼壁細(xì)胞的原位熒光顯微鏡檢測：
注：本方法的優(yōu)點(diǎn)是可以原位觀察細(xì)胞凋亡，缺點(diǎn)是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。
a.(選做)如果條件許可，把細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板內(nèi)。在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，用可以對多孔板進(jìn)行離心的離心機(jī)1000×g離心5分鐘。
b.吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌一次。如果條件許可，在吸除PBS前1000×g離心5分鐘。
c.加入195μl Annexin V-mCherry Binding Buffer。
d.加入5μl Annexin V-mCherry，輕輕混勻。
e.室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。
f.隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-mCherry為紅色熒光。注意：細(xì)胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內(nèi)完成檢測?