簡(jiǎn)介
? ? ? ?腦立體定位技術(shù)被廣泛運(yùn)用于對(duì)特定核團(tuán)或腦區(qū)的操控（激活或抑制）、給藥、病毒標(biāo)記和信號(hào)采集等實(shí)驗(yàn)中，成為研究腦的結(jié)構(gòu)和功能必不可少的實(shí)驗(yàn)手段。該技術(shù)以腦立體定位儀為主要定位儀器，結(jié)合動(dòng)物顱骨外表面固定標(biāo)志（如小鼠的前囟、后囟等位點(diǎn)）以及標(biāo)準(zhǔn)腦圖譜，來確認(rèn)目標(biāo)核團(tuán)或腦區(qū)的坐標(biāo)；再通過手術(shù)方式將外界的干預(yù)手段施于目標(biāo)位置，在非直視暴露下對(duì)其進(jìn)行精確定點(diǎn)操控、損毀、給藥、病毒標(biāo)記和信息采集等。
圖1.腦立體定位注射儀及工作場(chǎng)景
病毒注射
? ? ? ?在腦功能和結(jié)構(gòu)的研究中，常需要利用病毒工具將外源基因（熒光蛋白基因，離子通道蛋白基因等）整合到目標(biāo)腦區(qū)細(xì)胞的DNA上，借此標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞。常用的病毒包括腺相關(guān)病毒、慢病毒、狂犬病毒、單純皰疹病毒和水泡性口炎病毒等。
? ? ? ?根據(jù)客戶需要，我司負(fù)責(zé)將具體的病毒按提前制定的標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確注入目標(biāo)腦區(qū)。并設(shè)有P2實(shí)驗(yàn)室，可以提供級(jí)別更高的病毒（如狂犬病毒等）注射環(huán)境。
圖2.定位注射
光纖植入
? ? ? ?光遺傳學(xué)（Optogenetics）是指結(jié)合光學(xué)與遺傳學(xué)手段，精確控制特定神經(jīng)元活動(dòng)的技術(shù)。該技術(shù)利用分子生物學(xué)、病毒生物學(xué)等手段，將外源光敏感蛋白基因?qū)牖罴?xì)胞中，在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上表達(dá)了光敏感通道蛋白；然后通過特定波長(zhǎng)光的照射，控制細(xì)胞膜上的光敏感通道蛋白的激活與關(guān)閉；光敏感蛋白的激活和關(guān)閉可控制細(xì)胞膜上離子通道的打開與關(guān)閉，進(jìn)而改變細(xì)胞膜電壓的變化，如膜的去極化與超極化。當(dāng)膜電壓去極化超過一定閾值時(shí)就會(huì)誘發(fā)神經(jīng)元產(chǎn)生可傳導(dǎo)的電信號(hào)，即神經(jīng)元的激活；相反，當(dāng)膜電壓超極化到一定水平時(shí)，就會(huì)抑制神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏漠a(chǎn)生，即神經(jīng)元的抑制。
? ? ? ?我司可根據(jù)客戶需求將光纖埋置入指定區(qū)域，用于后續(xù)的激活或抑制實(shí)驗(yàn)。
? ? ? ?光遺傳學(xué)技術(shù)主要包括病毒包裝、病毒注射、光纖埋植、光調(diào)控、行為測(cè)試和電生理記錄6個(gè)步驟。
? ? ? ?我司也可提供完整的技術(shù)服務(wù)：
圖3.光遺傳實(shí)驗(yàn)中的小鼠
光纖鈣記錄
? ? ? ?鈣成像技術(shù)是指利用鈣離子指示劑（Calcium Indicator，CI）監(jiān)測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的方法。神經(jīng)鈣成像技術(shù)的原理就是借助鈣離子濃度與神經(jīng)元活動(dòng)之間的嚴(yán)格對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用特殊的熒光染料或者蛋白質(zhì)熒光探針即鈣離子指示劑，將神經(jīng)元中的鈣離子濃度通過熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來，從而達(dá)到監(jiān)測(cè)神經(jīng)元活動(dòng)的目的。目前常用的鈣成像技術(shù)包括光纖鈣記錄和雙光子鈣成像。
? ? ? ?光纖鈣記錄的實(shí)施方法：1、選擇合適的鈣離子指示劑；2、將鈣離子指示劑轉(zhuǎn)運(yùn)至目標(biāo)部位（化學(xué)熒光指示劑通常采用電極刺穿或借助乙酰氧基甲酯和右旋葡萄糖的方式進(jìn)入到目標(biāo)部位，而基因編碼指示劑則主要借助于病毒感染的方式導(dǎo)入至目標(biāo)部位）；3、光纖埋植以收集信號(hào)，記錄結(jié)果。光纖記錄無細(xì)胞分辨率，記錄不同腦區(qū)的群體神經(jīng)元活動(dòng)（僅限光纖探針尖端附近）；而雙光子鈣成像需要使用顱窗手術(shù)見后文。
圖4.光纖鈣記錄模式圖
顱骨表面腦電電極埋置
? ? ? ?腦電圖（Electroencephalogram，EEG）的獲取是通過精密的電子儀器，從頭皮上將腦部的自發(fā)性生物電位加以放大記錄而獲得。通過電極記錄下來的腦細(xì)胞群的自發(fā)性、節(jié)律性電活動(dòng)有常規(guī)腦電圖、動(dòng)態(tài)腦電圖監(jiān)測(cè)、視頻腦電圖監(jiān)測(cè)。現(xiàn)已被認(rèn)為是研究睡眠作用的重要組成部分。
圖5.腦電EEG電極埋置場(chǎng)景
深部腦區(qū)電極埋置
? ? ? ?動(dòng)物在體電生理記錄主要用于實(shí)時(shí)在線記錄大腦神經(jīng)元放電情況來量化及描述神經(jīng)環(huán)路的工作狀況。
? ? ? ?局部場(chǎng)電位（Local Field Potential，LFP）記錄的信號(hào)代表在記錄電極周圍少量神經(jīng)組織中胞外低頻電生理信號(hào)的總和，概括地反映記錄電極附近局部空間內(nèi)神經(jīng)元集群突觸活動(dòng)所造成的電場(chǎng)變化。局部場(chǎng)電位記錄到的數(shù)據(jù)反映的是一段時(shí)間內(nèi)所記錄核團(tuán)內(nèi)所有神經(jīng)元電學(xué)活動(dòng)的總體情況。我司可根據(jù)客戶需要提供電極埋置服務(wù)，以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的記錄等。
圖6.多通道電極埋置
顱窗植入
? ? ? ?腦科學(xué)研究中利用雙光子顯微鏡和基因編碼的鈣探針（如GCaMP）實(shí)現(xiàn)活體鈣成像的方式已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。這種研究活體生物神經(jīng)元功能的方式需要在目標(biāo)腦區(qū)植入顱窗。顱窗植入法即將小鼠顱骨去除后，使用透明玻璃取代顱骨，該方法可以維持大腦正常的生理狀態(tài)。一方面，可減少激發(fā)光透過顱骨的光損失，增加了皮層的成像深度；另一方面，顱窗可以重復(fù)長(zhǎng)時(shí)間使用，對(duì)于研究長(zhǎng)時(shí)間周期的神經(jīng)元群體或單神經(jīng)元活動(dòng)具有很好的效果。
? ? ? ?需要注意的是雙光子成像時(shí)動(dòng)物必須頭部固定或者動(dòng)物處于麻醉狀態(tài)，可記錄單個(gè)神經(jīng)元，更可觀察到皮層神經(jīng)元亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)軸突末端的鈣信號(hào)。
圖7.從左至右為顱窗植入手術(shù)流程
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